rna提取過程中(RNA提取分離純化時應注意什么?)

1.RNA提取分離純化時應注意什么?

真核細胞的mRNA分子最顯著的結構特征是具有5'端帽子結構（m7G）和3'端的Poly(A)尾巴。

絕大多數(shù)哺乳類動物細胞mRNA的3'端存在20-30個腺苷酸組成的Poly(A)尾，通常用Poly(A+)表示。這種結構為真核mRNA的提取，提供了極為方便的選擇性標志，寡聚（dT）纖維素或寡聚（U）瓊脂糖親合層析分離純化mRNA的理論基礎就在于此。

mRNA的分離方法較多，其中以寡聚（dT）-纖維素柱層析法最為有效，已成為常規(guī)方法。此法利用mRNA 3'末端含有Poly(A+)的特點，在RNA流經(jīng)寡聚（dT）纖維素柱時，在高鹽緩沖液的作用下，mRNA被特異地結合在柱上，當逐漸降低鹽的濃度時或在低鹽溶液和蒸餾水的情況下，mRNA被洗脫，經(jīng)過兩次寡聚（dT）纖維柱后，即可得到較高純度的mRNA。

寡聚（dT）纖維素柱純化mRNA 一、試劑準備 1.3M醋酸鈉（pH 5.2） 2.0.1M NaOH 3.1*上樣緩沖液：20mM Tris-HCl(pH 7.6);0.5M NaCl;1M EDTA(pH 8.0);0.1%SLS（十二烷基氨酸鈉。配制時可先配制Tris-HCl(pH 7.6)、NaCl、EDTA(pH 8.0)的母液，經(jīng)高壓消毒后按各成分確切含量，經(jīng)混合后再高壓消毒，冷卻至65℃時，加入經(jīng)65℃溫育（30min）的10%SLS至終濃度為0.1%。

4.洗脫緩沖液：10mM Tris-HCl(pH 7.6);1mM EDTA(pH 8.0);0.05% SDS 5.無水乙醇、70%乙醇 6.DEPC 二、操作步驟 1.將0.5-1.0g寡聚（dT）-纖維懸浮于0.1M的NaOH溶液中。 2.用DEPC處理的1ml注射器或適當?shù)奈埽瑢⒐丫郏╠T）-纖維素裝柱0.5-1ml，用3倍柱床體積的DEPC H2O洗柱。

3.使用1*上樣緩沖液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。 4.將RNA溶解于DEPC H2O中，在65℃中溫育10min左右，冷卻至室溫后加入等體2*上樣緩沖液，混勻后上柱，立即收集流出液。

當RNA上樣液全部進入柱床后，再用1*上樣緩沖液洗柱，繼續(xù)收集流出液。 5.將所有流出液于65℃加熱5min，冷卻至室溫后再次上柱，收集流出液。

6.用5-10倍柱床體積的1*上樣緩沖液洗柱，每管1ml分部收集，OD260測定RNA含量。前部分收集管中流出液的OD260值很高，其內(nèi)含物為無Poly(A)尾的RNA。

后部分收集管中流出液的OD260值很低或無吸收。 7.用2-3倍柱容積的洗脫緩沖液洗脫Poly(A+)RNA，分部收集，每部分為1/3-1/2柱體積。

8.OD260測定Poly(A+)RNA分布，合并含Poly(A+)RNA的收集管，加入1/10體積3M NaAc(pH5.2)、2.5倍體積的預冷無水乙醇，混勻，-20℃放置30min。 9.4℃離心，10000g*15min，小心吸棄上清。

用70%乙醇洗滌沉淀。[注意：此時Poly(A+)RNA的沉淀往往看不到]。

4℃離心，10000g*5min，棄上清，室溫晾干。 10. 用適量的DEPC H2O溶解RNA。

三、注意事項 1.整個實驗過程必須防止Rnase的污染。 2.步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然后冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結合，否則會導致rRNA的污染。

所以此步驟不能省略。 3.十二烷基肌氨酸鈉鹽在18℃以下溶解度下降，會阻礙柱內(nèi)液體流動，若室溫低于18℃最好用LiCl替代NaCl。

4.寡聚（dT）-纖維素柱可在4℃貯存，反復使用。每次使用前應該依次用NaOH、滅菌 ddH2O、上樣緩沖液洗柱。

5.一般而言，107哺乳動物培養(yǎng)細胞能提取1-5μg Poly(A+)RNA，約相當于上柱總RNA量的1%-2%。