病毒核酸提取(病毒核酸的提取需要注意哪些?)
1.病毒核酸的提取需要注意哪些?
.一定要注意冰上操作，低溫離心。
2.戴口罩和勤換手套，去任何東西都要帶著手套去取。
3.每次去器材的時(shí)候都要用鑷子去夾，鑷子要在酒精燈上燒一下。
4.所有的器材都要經(jīng)過(guò)DEPC浸泡后高壓后才可以使用，所需要的氯仿，酒精，異丙醇等都保證沒(méi)有被RNA酶污染，不能用沒(méi)有泡過(guò)DEPC的槍頭去提取液體，一定要用DEPC浸泡過(guò)的槍頭去吸，如果發(fā)現(xiàn)試劑有可能被污染了，要立即更換。
5.吸取上清一定不要吸到中間層的蛋白，如果吸到蛋白一定要重新用氯仿抽提，因?yàn)?，吸到的蛋白很可能?huì)對(duì)RNA產(chǎn)生降解作用。一定要少吸，不要貪多，RNA提取不要求量，更多的要求質(zhì)。
6.最后用75%的酒精洗一次就可以，盡量減少RNA提取時(shí)間。
7.最后一步，用DEPC水溶解RNA，不要用太多的體積，以保證RNA的濃度。
提取完后，電泳觀察結(jié)果，如果上面的兩條帶都比較清楚的話，說(shuō)明RNA提取的不錯(cuò)，可以一次多逆轉(zhuǎn)錄幾管，不要把RNA凍存，以后在逆轉(zhuǎn)錄的效果不好。
1. SARS病毒樣品是具有高度傳染性的樣品，樣品的采集、保存、運(yùn)輸、處理、實(shí)驗(yàn)應(yīng)遵循國(guó)家相應(yīng)的管理規(guī)范和生物安全條例，進(jìn)行樣品處理時(shí)必須做好相關(guān)的保護(hù)措施，并在P3實(shí)驗(yàn)室條件下小心操作，防止樣品飛濺，以確保實(shí)驗(yàn)人員安全。
2. 本試劑盒只適用于體外檢測(cè)。
3. 實(shí)驗(yàn)請(qǐng)分區(qū)操作：第一區(qū)為配液區(qū)：用來(lái)準(zhǔn)備擴(kuò)增所需試劑；第二區(qū)為樣品提取區(qū)：準(zhǔn)備樣品和對(duì)照品處理；第三區(qū)為擴(kuò)增區(qū)：PCR擴(kuò)增檢測(cè)。各區(qū)物品均為專用，不得交叉使用，避免污染，實(shí)驗(yàn)后立即清潔工作臺(tái)。
4. 本試劑盒中，樣品提取液可室溫避光保存，由于提取液低溫易結(jié)晶，為方便使用可先將提取液稍微加熱促溶，待結(jié)晶溶解后，再置于室溫避光處儲(chǔ)存。
5. 試劑盒各樣品管使用前，充分融化后混勻，并稍微離心。反應(yīng)液分裝時(shí)和加模板時(shí)都應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡，上機(jī)前各反應(yīng)管注意蓋緊，以免熒光物質(zhì)污染儀器。
6. 擴(kuò)增后，應(yīng)避免打開(kāi)PCR反應(yīng)管，以免造成污染，廢棄物品務(wù)請(qǐng)滅菌消毒后丟棄。工作臺(tái)及各物品定期用10%次氯酸鈉、75%酒精或紫外燈處理。
7. 由于SARS為RNA病毒，提取過(guò)程中應(yīng)特別注意防止RNA酶對(duì)其的降解作用，所用加樣器、離心管、槍尖等均為專用，操作人員需穿潔凈實(shí)驗(yàn)服，戴一次性手套和口罩，并且要勤換手套，減少RNA酶污染及交叉污染風(fēng)險(xiǎn)。
8. 本試劑所用的控制品為人工合成蛋白外殼包裹的假病毒，無(wú)感染性。
2.從血液標(biāo)本中提取病毒核酸有什么需要注意
從血液標(biāo)本中提取病毒核酸有什么需要注意
標(biāo)本的采集非常重要。 細(xì)菌感染通常是通過(guò)培養(yǎng)的方法檢測(cè)的，而病毒通常是通過(guò)抗原或者核酸來(lái)檢測(cè)的。 細(xì)菌培養(yǎng)和鑒定，以及藥敏試驗(yàn)，是合理使用抗菌藥物的前提，好的標(biāo)本決定一切，這是檢驗(yàn)領(lǐng)域的一句俗話。不恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本、不恰當(dāng)?shù)牟杉瘯r(shí)間、不規(guī)范的采集方法，很可能造成假陰性，假陽(yáng)性，雜菌污染等，延誤診斷，危及生命。 對(duì)于嚴(yán)重感染，我們是需要確定病原菌的，標(biāo)本應(yīng)該選擇細(xì)菌可能定植的部位，如深部痰液，胸水，血液等，標(biāo)本提取的時(shí)間應(yīng)該在抗菌藥物使用前，最好在發(fā)生寒戰(zhàn)的時(shí)候。標(biāo)本的采集一定要規(guī)范，避免把護(hù)士或醫(yī)生手上，導(dǎo)管，或者采集器本身的雜菌帶入標(biāo)本。 病毒感染較少檢測(cè)，除了一些特殊的，如肝炎病毒，巨細(xì)胞病毒，以及其他一些傳染病病毒等。病毒要達(dá)到一定拷貝量，才能用核酸定量的方法檢測(cè)出來(lái)。而抗原抗體檢測(cè)，相對(duì)來(lái)水受到標(biāo)本影響較小。
3.病毒DNA提取技巧?
以下是從動(dòng)物病毒中快速提取DNA的方法，請(qǐng)參考該方案采用離心操作，適合于從動(dòng)物組織樣品中快速提取病毒基因組DNA。
以下步驟都在室溫下進(jìn)行。 1. 取50-100mg的動(dòng)物組織加入約3倍體積的生理鹽水進(jìn)行勻漿，充分勻漿后10,000rpm離心2min去除殘余組織。
2. 取150 μl上清液至新的潔凈離心管中。 3. 加入500 μl DNA提取液至上清液中，顛倒混勻，室溫靜置5-10min裂解病毒。
4. 把DNA吸附柱裝在2ml收集管中，把裂解后的液體全部轉(zhuǎn)移至DNA吸附柱中，10,000 rpm離心1 min。 5. 倒棄濾液，把DNA吸附柱裝回收集管中，加入400 μl洗滌液至DNA吸附柱中，10,000 rpm離心1 min。
注：洗滌液初次使用前請(qǐng)先加入48 ml無(wú)水乙醇。使用完立即蓋上蓋，以防乙醇揮發(fā)。
6. 重復(fù)步驟5。 7. 倒棄收集管中的濾液，把DNA吸附柱裝回收集管中，10,000 rpm離心3 min。
8. 把DNA吸附柱裝在新的潔凈離心管中，加入30-50 μl洗脫液至吸附柱中央，靜置1-2min,10,000 rpm離心1min，所得即為DNA溶液，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，若暫時(shí)不用，應(yīng)于-20 ℃可儲(chǔ)存。
4.生化實(shí)驗(yàn)——?jiǎng)游锝M織中核酸的提取與鑒定,在提取核酸過(guò)程中,要注
這要看你要提的核酸式DNA還是RNA.首先說(shuō)一下DNA吧，一，首先要用10%的SDS處理勻漿器，這樣可以除去勻漿器中的污染。
二，最好在冰上進(jìn)行，防止降解
三，要加足夠的RNA酶及蛋白酶K使RNA及蛋白質(zhì)進(jìn)行充分的降解，而利于后面的抽提
四，抽提時(shí)要注意吸取上抄層，但不要弄破中間白色的蛋白層
五，用75%乙醇洗后，帶乙醇揮發(fā)后再用無(wú)菌水溶解
對(duì)于RNA 的提取最主要的就是要防止RNA酶對(duì)RNA的降解。首先就是要對(duì)所用試劑用DEPC處理。
第二，對(duì)于動(dòng)物組zd織塊，從負(fù)70拿出后，立即用勻漿器搗碎，以后各步驟要在冰上進(jìn)行。
5.核酸檢測(cè)應(yīng)該注意事項(xiàng)
一、核酸檢測(cè)流程：
(1)發(fā)熱門(mén)診患者：可在發(fā)熱門(mén)診進(jìn)行核酸采集，檢測(cè)結(jié)果一般在發(fā)熱門(mén)診領(lǐng)取。
(2)入院患者或自愿接受核酸檢測(cè)人員：掛號(hào)后在各?？崎T(mén)診開(kāi)具相關(guān)檢測(cè)單，繳費(fèi)后按照指示牌到“核酸采集門(mén)診”進(jìn)行采樣，檢測(cè)結(jié)果可到門(mén)診自助機(jī)打印領(lǐng)取。
(3)急診需要住院的患者：急診就診的危急重癥在急診科進(jìn)行核酸采集，采集后到相應(yīng)科室住院，檢測(cè)結(jié)果在門(mén)診自助機(jī)打印領(lǐng)取。
二、核酸檢測(cè)怎么做？
新型冠狀病毒的核酸檢測(cè)取樣方法很簡(jiǎn)單，只要“輕輕一抹”。到了發(fā)熱門(mén)診或者是相應(yīng)的檢查室，工作人員會(huì)讓患者張開(kāi)嘴，用一個(gè)像棉簽一樣的拭子去擦拭扁桃體和咽隱窩附近的分泌物，也可以通過(guò)鼻腔取鼻咽后部的分泌物，然后放到試管里面，再交給檢驗(yàn)科去做相應(yīng)的病毒核酸的檢查。
三、核酸檢測(cè)的注意事項(xiàng)
(1)采樣前請(qǐng)清水漱口，2小時(shí)內(nèi)避免進(jìn)食。
(2)采樣前30分鐘請(qǐng)勿吸煙、勿喝酒、勿嚼口香糖等。
(3)來(lái)醫(yī)院體檢時(shí)，請(qǐng)盡量選擇非公共交通工具。
(4)進(jìn)入采樣場(chǎng)地前，請(qǐng)配合工作人員進(jìn)行體溫檢測(cè)及流行病學(xué)調(diào)查。
(5)被檢測(cè)者必須佩戴口罩，同時(shí)準(zhǔn)備一個(gè)備用口罩。
(6)所有等候檢測(cè)人員一定要保持1米以上距離，避免交談。
(7)采集完畢后立即洗手或使用速干手消毒劑擦拭雙手，戴上備用口罩。
6.核酸分離提取的原則是什么
核酸分離提取的原則
核酸包括DNA、RNA兩種分子，在細(xì)胞中都是以與蛋白質(zhì)結(jié)合的狀態(tài)存在。真核生物的染色體DNA為雙鏈線性分子，原核生物的“染色體”、質(zhì)粒及真核細(xì)胞器DNA為雙鏈環(huán)狀分子；有些嗜菌體DNA有時(shí)為單鏈環(huán)狀分子，RNA分子在大多數(shù)生物體內(nèi)均是單鏈線性分子，不同類型的RNA分子可以具有不同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，如真核mRNA分子多數(shù)在3'端帶有poly(A)結(jié)構(gòu)，至于病毒的DNA、RNA分子，其存在形式多種多樣，有雙鏈環(huán)狀、單鏈環(huán)狀、雙鏈線狀及單鏈線狀等。
95%的真核生物DNA主要存在于細(xì)胞核內(nèi)，其它5%為細(xì)胞器DNA，如線粒體、葉綠體等。RNA分子則主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，約占75%，另有10%在細(xì)胞核內(nèi)，15%在細(xì)胞器中，RNA以rRNA的數(shù)量最多（80%-85%）,tRNA及核內(nèi)小分子RNA占10%-15%，而mRNA分子大小不一，序列各異?？偟膩?lái)說(shuō)，DNA分子的總長(zhǎng)度一般隨著生物的進(jìn)化程度而增大，而RNA的分子量與生物進(jìn)化無(wú)明顯關(guān)系。
分離純化核酸總的原則：
1.應(yīng)保證核酸一級(jí)結(jié)構(gòu)的完整性；2.排除其它分子的污染。
為了保證核酸結(jié)構(gòu)與功能的研究，完整的一級(jí)結(jié)構(gòu)是最基本的要求，因?yàn)檫z傳信息全部貯存在一級(jí)結(jié)構(gòu)之中，核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)還決定其高級(jí)結(jié)構(gòu)的形式以及和其它生物大分子結(jié)合的方式。對(duì)于核酸的純化應(yīng)達(dá)到以下三點(diǎn)要求：
1.核酸樣品中不存在對(duì)酶有抑制作用的有機(jī)溶劑和過(guò)高濃度的金屬離子；
2. 其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分子的污染應(yīng)降到最低程度；
3. 排除其它核酸分子的污染，如提取DNA分子時(shí)應(yīng)去除RNA，反之亦然.
為了保證分離核酸的完整性和純度，在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，應(yīng)注意以下事項(xiàng)：
1. 盡量簡(jiǎn)化操作步驟，縮短提取過(guò)程，以減少各種有害因素對(duì)核酸的破壞；
2.減少化學(xué)因素對(duì)核酸的降解，為避免過(guò)酸、過(guò)堿對(duì)核酸鏈中磷酸二酯鍵的破壞，操作多在pH4-10的條件下進(jìn)行；
3.減少物理因素對(duì)核酸的降解，物理降解因素主要是機(jī)械剪切力，其次是高溫。機(jī)械剪切力包括強(qiáng)力高速的溶液振蕩、攪拌，使溶液快速地通過(guò)狹長(zhǎng)的孔道，細(xì)胞突然置于低滲液中，細(xì)胞爆炸式破裂以及DNA樣本的反復(fù)凍貯。這些操作細(xì)節(jié)在實(shí)驗(yàn)操作中應(yīng)倍加注意。機(jī)械剪切作用的主要危害對(duì)象是大分子量的線性DNA分子，如真核細(xì)胞的染色體DNA。對(duì)分子量小的環(huán)狀DNA分子，如質(zhì)粒DNA及RNA分子，威脅相對(duì)小些。高溫如長(zhǎng)時(shí)間煮沸，除水沸騰帶來(lái)的剪切力外，高溫本身對(duì)核酸分子中的有些化學(xué)鍵也有破壞作用。核酸提取過(guò)程中，一般在低溫操作，但現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)在室溫快速提取與低溫提取，獲得核酸的質(zhì)量沒(méi)有太大差異.
4.防止核酸的生物降解，細(xì)胞內(nèi)或外來(lái)的各種核酸酶消化核酸鏈中的磷酸二酯鍵，直接破壞核酸的一級(jí)結(jié)構(gòu)，其中DNA酶，需要金屬二價(jià)離子Mg2 、Ca2 的激活，使用EDTA、檸檬酸鹽螯合金屬二價(jià)離子，基本可以抑制DNA酶活性。而RNA酶不但分布廣泛，極易污染樣品，而且耐高溫、耐酸、耐堿、不易失活，所以是生物降解RNA提取過(guò)程的主要危害因素.
核酸提取的主要步驟，無(wú)外乎破碎細(xì)胞，去除與核酸結(jié)合的蛋白質(zhì)以及多糖、脂類等生物大分子，去除其它不需要的核酸分子，沉淀核酸，去除鹽類，有機(jī)溶劑等雜質(zhì)，純化核酸等。核酸提取的方案，應(yīng)根據(jù)具體生物材料和待提取的核酸分子的特點(diǎn)而定，對(duì)于某特定細(xì)胞器中富集的核酸分子，事先提取該細(xì)胞器，然后提取目的核酸分子的方案，可獲得完整性和純度兩方面質(zhì)量均高的核酸分子。
7.做核酸檢測(cè)有什么注意事項(xiàng)
1、為避免出現(xiàn)嘔吐情況采樣前2小時(shí)請(qǐng)勿進(jìn)食； 2、釆樣前30分鐘請(qǐng)勿吸煙、喝酒、嚼口香糖等； 3、盡量在單獨(dú)密閉空間采樣，采樣后開(kāi)窗通風(fēng)，任何時(shí)候都不要用手或其他物品觸及拭子采樣冠（棉簽前端）； 4、在采集口咽拭子時(shí)檢測(cè)者頭后仰，張口發(fā)出"啊"音，有助于暴露咽喉，采樣過(guò)程無(wú)特殊不適，但部分敏感人員可能出現(xiàn)刺激性干咳、惡心、嘔吐等癥狀，休息后即可緩解，受檢者可配合采集人員盡量放松、保持深呼吸，大部分人員可避免不適； 5、檢測(cè)者要戴口罩，同時(shí)準(zhǔn)備一個(gè)備用口罩，要保持人際1米以上距離，勿擁擠； 6、接受咽拭子采樣時(shí)，將口罩取下折疊封裝在塑料袋里放入口袋中，釆集完樣品后立即洗手或用免洗酒精擦拭雙手，戴上備用口罩，將廢棄口罩投入指定醫(yī)用垃圾桶； 7、在采集鼻咽拭子前檢測(cè)者應(yīng)告知采集人員是否鼻中隔彎曲及鼻腔手術(shù)史，過(guò)程中可能出現(xiàn)鼻部酸癢感，刺激打噴嚏，可立即用紙巾或手肘遮擋； 8、鼻咽拭子采集后可能出現(xiàn)少量鼻腔出血，一般不需要特殊處理，如出血量較多請(qǐng)及時(shí)到醫(yī)院進(jìn)行處理。
另外，血清抗體檢測(cè)不受飲食影響，無(wú)需空腹。擴(kuò)展資料： 核酸檢測(cè)的四類重點(diǎn)人群： 1、有相關(guān)癥狀者 出現(xiàn)咳嗽、發(fā)熱等相關(guān)癥狀，尤其是近期有可能接觸過(guò)確診病例的人。
2、重點(diǎn)崗位工作者 醫(yī)務(wù)人員，餐廳服務(wù)員，警察，外賣(mài)，配送員。 3、高風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域人員 確診病例曾經(jīng)到過(guò)的地區(qū)的人，及其密切接觸者也應(yīng)該重視。
4、近期入境人群及密切接觸者核酸檢測(cè)法 - 搜狗百科核酸檢測(cè)法（英文名：Nucleic acid detection method）是通過(guò)查找患者的呼吸道標(biāo)本、血液或糞便中是否存在外來(lái)入侵的病毒的DNA和RNA，來(lái)判斷是否被病毒感染的方法，是新型冠狀病毒感染確診的金標(biāo)準(zhǔn)。新冠病毒感染人體之后，首先會(huì)在呼吸道系統(tǒng)中進(jìn)行繁殖，因此可以通過(guò)檢測(cè)痰液、鼻咽拭子中的病毒核酸判斷人體是否感染病毒。
/v66902107.htm?fromTitle=%E6%A0%B8%E9%85%B8%E6%A3%80%E6%B5%8B。
8.分離純化核酸有哪些注意事項(xiàng)
使用方法因廠家不同而不同，下面是一氪生物技術(shù)的核酸純化試劑使用方法及注意事項(xiàng)，供參考： 步驟一：使用無(wú)水乙醇與純化水配制70%乙醇備用。
步驟二：從2-8℃冰箱中取出磁珠懸浮液，在室溫條件下震蕩混勻，平衡30min。 步驟三：將充分震蕩混勻平衡后的磁珠加入待純化酶反應(yīng)或PCR反應(yīng)產(chǎn)物溶液中。
磁珠加入體積分別參考圖1和圖2，若待純化產(chǎn)物體積不足，可用純化水或10mM Tris-HCl(pH8.0)補(bǔ)充至相應(yīng)體積。 步驟四：用移液器反復(fù)吹打10次，將磁珠懸浮液和PCR產(chǎn)物或者酶反應(yīng)物充分混勻，室溫條件下靜置5min。
步驟五：將反應(yīng)板放置在磁力架上，靜置2min，待溶液澄清后將上清吸走，轉(zhuǎn)入廢液桶內(nèi)。 步驟六：向反應(yīng)板中加入200μL新鮮配置的70%的乙醇，室溫靜置30s。
靜置結(jié)束后將乙醇吸走，轉(zhuǎn)入廢液桶內(nèi)。操作環(huán)節(jié)不可將反應(yīng)板從磁力分離架上拿下或?qū)⒋胖榇瞪ⅰ?/p>
步驟七：重復(fù)步驟六。 步驟八：保持反應(yīng)板置于磁力架上狀態(tài)，室溫開(kāi)蓋晾干2min以去除殘存的乙醇。
步驟九：將反應(yīng)板從磁力架上取下來(lái)，加入50μL洗脫液，移液器反復(fù)吹打10次混勻，室溫靜置3min。洗脫液加入量根據(jù)實(shí)際需要而定，但應(yīng)不少于5μL。
步驟十：將反應(yīng)板重新放置在磁力架上，室溫靜置1min，上清液即純化后的DNA產(chǎn)物。 步驟十一：將上清液轉(zhuǎn)入新的反應(yīng)管或者反應(yīng)板中，供下一步反應(yīng)或檢測(cè)使用。
