大腸桿菌菌種的制備(大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備要注意哪些因素)
1.大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備要注意哪些因素
(1)質(zhì)粒DNA的質(zhì)量和濃度： 用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA應(yīng)主要是超螺旋態(tài)的，轉(zhuǎn)化率與外源DNA的濃度在一定范圍內(nèi)成正比，但當(dāng)加入的外源DNA的量過(guò)多或體積過(guò)大時(shí)，則會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。
一般地，DNA溶液的體積不應(yīng)超過(guò)感受態(tài)細(xì)胞體積的5%,1ng的cccDNA即可使50ul的感受態(tài)細(xì)胞達(dá)到飽和。對(duì)于以質(zhì)粒為載體的重組分子而言，分子量大的轉(zhuǎn)化效率低，實(shí)驗(yàn)證明，大于30kb的重組質(zhì)粒將很難進(jìn)行轉(zhuǎn)化。
此外，重組DNA分子的構(gòu)型與轉(zhuǎn)化效率也密切相關(guān)，環(huán)狀重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率較分子量相同的線性重組質(zhì)粒高10~100倍，因此重組DNA大都構(gòu)成環(huán)狀雙螺旋分子。 （2）感受態(tài)細(xì)胞的質(zhì)量： 所用的CaCl2等試劑均需是最高純度的，并用最純凈的水配制，最好分裝保存于4℃ （3）細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和密度 最好從-70℃或-20℃甘油保存的菌種中直接轉(zhuǎn)接用于制備感受態(tài)細(xì)胞的菌液。
不要用已經(jīng)過(guò)多次轉(zhuǎn)接，及貯存在4℃的培養(yǎng)菌液。細(xì)胞生長(zhǎng)密度以每毫升培養(yǎng)液中的細(xì)胞數(shù)在5*107個(gè)左右為佳。
即應(yīng)用對(duì)數(shù)期或?qū)?shù)生長(zhǎng)前期的細(xì)菌，可通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)液的OD600控制。對(duì)TG1菌株，OD600為0.5時(shí)，細(xì)胞密度在5*107個(gè)/ml左右。
（應(yīng)注意OD600值與細(xì)胞數(shù)之間的關(guān)系隨菌株的不同而不同）。密度過(guò)高或不足均會(huì)使轉(zhuǎn)化率下降。
（二）感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的影響： 整個(gè)操作過(guò)程均應(yīng)在無(wú)菌條件下進(jìn)行，所用器皿，如離心管，移液槍頭等最好是新的，并經(jīng)高壓滅菌處理。所有的試劑都要滅菌，且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染，否則均會(huì)影響轉(zhuǎn)化效率或雜DNA的轉(zhuǎn)入。
整個(gè)操作均需在冰上進(jìn)行，不能離開(kāi)冰浴，否則細(xì)胞轉(zhuǎn)化率將會(huì)降低。
2.感受態(tài)細(xì)胞的制備時(shí)有什么注意事項(xiàng)
方法一：細(xì)菌轉(zhuǎn)化的方法多以Mendel和Higa(1970)的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，其基本方法是用冰預(yù)冷的CaCl2或多種2價(jià)陽(yáng)離子等處理細(xì)菌，使之進(jìn)入感受態(tài)得以轉(zhuǎn)化。
用CaCl2制備新鮮或冷凍的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，常用于成批制備感受態(tài)細(xì)菌。本法適用于大多數(shù)大腸桿菌菌株，且迅速、重復(fù)性好。
操作過(guò)程簡(jiǎn)述如下。1.從37℃培養(yǎng)16~20h的新鮮平板中挑取一個(gè)單菌落（如大腸桿菌DH52），或1ml新鮮的16~20h過(guò)夜培養(yǎng)物，轉(zhuǎn)到一個(gè)含有100mlLB培養(yǎng)基的1L或500ml燒瓶中。
于37℃劇烈振搖培養(yǎng)約2~3h（旋轉(zhuǎn)搖床200~300r/min），每隔20~30min測(cè)量OD600值≈0.4。2.在無(wú)菌條件下將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)，用冰預(yù)冷的50ml聚丙烯離心管中，在冰上放置10~20min。
3.于4℃用SorvallGS2轉(zhuǎn)頭（或與其離心管相配的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。4.倒數(shù)培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。
5.以10ml用冰預(yù)冷的0.1mMCaCl2重懸每份沉淀，放于冰上。6.于4℃用SorvallGS3轉(zhuǎn)頭（或與其相應(yīng)的轉(zhuǎn)頭）以4000r/min離心10min，以回收細(xì)胞。
7.倒出培養(yǎng)液，將管倒置1min以使最后殘留的痕量培養(yǎng)液流盡。8.每50ml初始培養(yǎng)物用2ml冰預(yù)冷的0.1MCaCl2重懸每份沉定，此時(shí)，可以迅速將細(xì)胞分裝成小份，液氮中冰凍，-70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
9.用冷卻的無(wú)菌吸頭從每種感受態(tài)細(xì)胞懸液中各取200μl轉(zhuǎn)移到無(wú)菌的微量離心管中，每管加DNA或連接反應(yīng)混合物（體積≤10μl,DNA≤50ng），輕輕旋轉(zhuǎn)以混勻內(nèi)容物，在冰中放置30min。10.將離心管放到預(yù)加溫到40℃的循環(huán)水浴中的試管架上，放置90s~2min，不要搖動(dòng)試管。
11.快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴中，使細(xì)胞冷卻1~2min。12.每離心管加800μlSOC培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫到37℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37℃搖床上，溫育45min使細(xì)菌復(fù)蘇，并且表達(dá)質(zhì)粒編碼的抗生素抗性標(biāo)記基因。
13.將適當(dāng)體積（每個(gè)90mm平板可達(dá)200μl）已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含200mmol/lMgSO4和相應(yīng)抗生素的SOB培養(yǎng)基上。14.將平板置于室溫至液體被吸收。
15.倒置平皿，于37℃培養(yǎng)，12~16h后可出現(xiàn)菌落。方法二：CASsuperOne-采用一種簡(jiǎn)單便捷的方法處理大腸桿菌，使其成為感受態(tài)細(xì)胞，便于質(zhì)粒DNA的轉(zhuǎn)化，可滿足一般實(shí)驗(yàn)的要求。
與CaCl2法相比具有多種優(yōu)點(diǎn)：使用方便，只需一步即可完成感受態(tài)細(xì)胞的制備；轉(zhuǎn)化效率略高于CaCl2法，一般可達(dá)106-108cfu/μg，滿足一般實(shí)驗(yàn)需要；感受態(tài)細(xì)胞制成后即可保存于-70℃，無(wú)須加入甘油，并且經(jīng)長(zhǎng)期保存活力無(wú)明顯下降。準(zhǔn)備工作：1.從液氮或低溫冰箱中取出的大腸桿菌凍存菌，在LB平板上劃線，37度過(guò)夜至長(zhǎng)出單菌落。
挑形態(tài)飽滿的單菌落2個(gè)，分別接種5mlLB培養(yǎng)基中，37℃，250rpm，過(guò)夜培養(yǎng)。2.次日從5mlLB培養(yǎng)物吸取200μl轉(zhuǎn)入50mlLB培養(yǎng)基中（250ml錐形瓶），37℃，250rpm培養(yǎng)2小時(shí)，此時(shí)OD600約0.4—0.5。
感受態(tài)細(xì)胞的制備：3.吸取1ml菌液到1.5ml離心管里，5000rpm離心5分鐘，棄去上清。4.加入100μl預(yù)冷的SolutionA，懸浮菌體，冰浴30分鐘。
5.此時(shí)感受態(tài)細(xì)胞已經(jīng)制成可立即使用或-70℃保存。細(xì)胞轉(zhuǎn)化：6.在感受態(tài)細(xì)胞中加入100pg-10ngDNA，混勻，冰浴30分鐘，然后42℃1分鐘熱擊，再次冰浴2分鐘。
加入0.9mlLB培養(yǎng)基，20μlSolutionB,37℃，振蕩培養(yǎng)1小時(shí)。7.取適當(dāng)菌液（100-200μl）涂布相應(yīng)抗性的平板。
8.過(guò)夜培養(yǎng)約16個(gè)小時(shí)，數(shù)菌落數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)化率。補(bǔ)充說(shuō)明：1.所用器具一定要清潔；2.操作步驟2中培養(yǎng)基的裝量也是很重要的，建議裝量不要高于此值：500ml錐形瓶裝100ml培養(yǎng)基，250ml錐形瓶裝50ml培養(yǎng)基；3.在收獲菌體前半小時(shí)還可以在培養(yǎng)基中加入20mM的MgCl2，效果會(huì)更好一些；4.為保證細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)后的菌體的OD值不要高于0.6;5.制備感受態(tài)細(xì)胞時(shí)所有操作盡量保證在冰上操作；6.細(xì)胞轉(zhuǎn)化操作步驟6中也可以不必進(jìn)行熱擊，冰浴后直接加入新鮮LB，簡(jiǎn)化操作步驟，但轉(zhuǎn)化效率低于熱擊方法，適用于對(duì)轉(zhuǎn)化率要求不高的實(shí)驗(yàn)。
方法三：1、取1%大腸桿菌E.coli接種于含2mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜2、取0.1ml過(guò)夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10mlLB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3h至OD600=0.3ml離心管中，冰浴10min。4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液5、把菌體懸浮于15m1冰冷的0.1MCaCl2溶液中，置冰上30min6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液7、將菌體懸浮于0.1mlCaCl2溶液中，冰浴放置4-12hr備用。
方法四：（1）將1ml過(guò)夜培養(yǎng)的細(xì)菌（如DH52、TG1、TM101）接種于100ml2*YT培養(yǎng)于500ml燒瓶。于37℃刷烈振蕩，通?！?00rpm培養(yǎng)的細(xì)菌密度約OD550=0.2~0.5(5*107cells/ml)，需2~4h。
(2)將培養(yǎng)物放于冰上致冷10min，于4℃離心細(xì)菌培養(yǎng)物，10000rpm離心10min。(3)棄除上清，將細(xì)菌懸浮于原始培養(yǎng)體積的一半（約50ml）的50mMCaCl2和10mmTris·HCl(pH8.0)無(wú)菌冷凍液體中。
（4）將細(xì)菌懸浮放在冰上約5min，然后將懸浮物于4℃10000/rpm離心10min。(5)棄上清，懸浮細(xì)菌于原始培養(yǎng)體積的1/15的50mMCaCl和10mMTris·HCl(pH8.0)無(wú)菌冷凍中。
此時(shí)的細(xì)。
3.大腸桿菌發(fā)酵的實(shí)驗(yàn)步驟 詳細(xì)點(diǎn)(比如操作過(guò)程中的注意事項(xiàng)) 謝謝
1、種子接種：將凍干管或甘油管種子接種到LB培養(yǎng)基搖瓶中進(jìn)行活化，一般可以加抗性標(biāo)記對(duì)應(yīng)的抗生素。然后搖床恒溫培養(yǎng)。
2、發(fā)酵培養(yǎng)基準(zhǔn)備：搖瓶的話好說(shuō)，滅菌鍋就行。發(fā)酵罐的話，要先將罐子清洗干凈，然后配料，然后滅菌。
3、將培養(yǎng)好的種子液，按一定的接種量接到發(fā)酵培養(yǎng)基中。如果是搖瓶發(fā)酵的話一般不用中控，時(shí)間到了放瓶即可。如果是發(fā)酵罐發(fā)酵的話，中間過(guò)程需要補(bǔ)料、調(diào)節(jié)PH值、控制好溶氧轉(zhuǎn)速等等。要注意取樣時(shí)樣液的密封性，如果樣液到處亂撒，容易導(dǎo)致噬菌體污染。
4、不論是產(chǎn)酶、蛋白、氨基酸還是別的什么，產(chǎn)物量都是必須檢測(cè)的哦。
5、放罐后，也要注意料液的收集、使用和滅活，嚴(yán)防噬菌體污染。
4.大腸桿菌菌種液的配制具體步驟
復(fù)蘇：
配制LB固體培養(yǎng)基，高壓蒸汽滅菌，倒平板。
挑取菌種，在培養(yǎng)基上劃線。
37℃培養(yǎng)24h至長(zhǎng)出菌落。
搖菌
配制LB液體培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌。
無(wú)菌試管內(nèi)加入3ml LB培養(yǎng)基，挑取單菌落加入培養(yǎng)基中，37℃，200rpm搖菌過(guò)夜。
擴(kuò)大培養(yǎng)：
配制LB液體培養(yǎng)基。高壓蒸汽滅菌。
三角瓶中加入50ml液體LB培養(yǎng)基，加入1ml菌液，37℃，200rpm搖菌至所需OD值。
注：培養(yǎng)基內(nèi)需加入菌株所具有抗性的抗生素。
工具：超凈工作臺(tái)、酒精燈、接種針、試管、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)皿等。
注意無(wú)菌操作。
