植物遺傳轉(zhuǎn)化的(植物體雜交注意事項(xiàng))

1.植物體雜交注意事項(xiàng)

植物體細(xì)胞雜交（plant somatic hybridization），又稱原生質(zhì)體融合（Protoplast fusion ）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質(zhì)體通過人工方法誘導(dǎo)融合，然后進(jìn)行離體培養(yǎng)，使其再生雜種植株的技術(shù)。植物細(xì)胞具有細(xì)胞壁，未脫壁的兩個(gè)細(xì)胞是很難融合的，植物細(xì)胞只有在脫去細(xì)胞壁成為原生質(zhì)體后才能融合，所以植物的細(xì)胞融合也稱為原生質(zhì)體融合。

說(shuō)道植物細(xì)胞融合，它和動(dòng)物細(xì)胞融合還是有很大差別的。

第一，前者因?yàn)橛屑?xì)胞壁，對(duì)融合有負(fù)面影響，首先要除壁變成原生質(zhì)體，可以用纖維素酶和果膠酶除壁。

第二，后者除了要加必要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還要加血清保持環(huán)境穩(wěn)定。

細(xì)胞融合方法主要有化學(xué)、生物和物理方法。一般學(xué)生實(shí)驗(yàn)室使用PEG（主要含有聚乙二醇）法融合。其優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單不需要特殊的設(shè)備。只需在去壁的細(xì)胞加入適量的PEG處理適當(dāng)?shù)臅r(shí)間，然后終止PEG的作用，然后在普通光學(xué)顯微鏡即可看到融合細(xì)胞。這種方法也有缺點(diǎn)，如不好控制PEG作用的時(shí)間，而且PEG對(duì)細(xì)胞也可能有害。

只有處理時(shí)間得當(dāng)，細(xì)胞壁去除了才可能提高成活率。

優(yōu)點(diǎn)：植物體細(xì)胞雜交是兩種異源原生質(zhì)體，在誘導(dǎo)劑誘發(fā)下相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和核融合并形成雜種細(xì)胞，進(jìn)一步發(fā)育成雜種植物體。通過細(xì)胞融合技術(shù)可以克服種、屬以上職務(wù)有性雜交不親和障礙，為廣泛重組遺傳物質(zhì)開辟了新途徑，也為攜帶外源遺傳物質(zhì)（信息）的大分子滲入細(xì)胞創(chuàng)造了條件，從而更進(jìn)一步擴(kuò)大了遺傳物質(zhì)的重組范圍。

2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化過程中為什么必須要誘導(dǎo)植物regeneration

幾種常用的植物轉(zhuǎn)基因方法

遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)再生植株可分成兩大類，第一類據(jù)要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法；另一類不需要通過組織培養(yǎng)，目前比較成熟的主要有花粉管通道法。

1農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙于葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠瘓瘤或發(fā)狀根。根想農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。 農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙于葉植物中，近年來(lái)，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在一些單子葉植物（尤其是水稻）中也得到了廣泛應(yīng)用。

2基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法

利用火爆炸或高壓氣體加速（這一加速設(shè)備被稱為基因槍），將包裹了帶目的基因的

DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細(xì)胞中，然后通過細(xì)腦和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，基因槍法轉(zhuǎn)化的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對(duì)簡(jiǎn)單，因此也是目前轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。

3花粉管通道法

在授粉后向于房含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。該方法于印年代初期由我國(guó)學(xué)者周光字提出，我國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來(lái)的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。

3.植物染色體標(biāo)本的制備的注意事項(xiàng)

植物染色體制片技術(shù)是植物細(xì)胞遺傳學(xué)、染色體工程、植物細(xì)胞生物學(xué)、植物細(xì)胞分類學(xué)和物種生物學(xué)等眾多學(xué)科的基本實(shí)驗(yàn)技術(shù)。植物染色體的研究由于和植物遺傳育種工作的結(jié)合而獲得良好的發(fā)展。因此，植物染色體的技術(shù)在這些研究工作中具有特別重要的意義[1-3]。Belling(1921)提出染色體壓片技術(shù)后，植物壓片已成為植物染色體研究中廣泛應(yīng)用的常規(guī)技術(shù)[1]。但是由于植物細(xì)胞有很堅(jiān)實(shí)的細(xì)胞壁，染色體很難像動(dòng)物染色體那樣平整地貼在載玻片上。陳瑞陽(yáng)（1982）提出了植物染色體標(biāo)本制備的酶解去壁低滲法。本文以韭蘭為材料，對(duì)植物染色體常規(guī)壓片，去壁低滲法制片技術(shù)、染色效果進(jìn)行了比較，以期在不同的材料及條件下選擇適宜的染色體制片技術(shù)，從而獲得較好的效果。

1 材料與方法

1.1 供試材料 試驗(yàn)用植株由校園內(nèi)采集。

1.2 根尖制片

1.2.1 常規(guī)壓片 通常是在早上9-10點(diǎn)采集蔥蘭的根然后在室溫下放入0.1%秋水仙素溶液中進(jìn)行預(yù)處理處理8 h。然后就在常溫把材料放在卡諾氏固定液下固定10m，接下來(lái)就在1 mol/L鹽酸溶液中解離到松軟剛合適為止。最后是用蒸餾水將蔥蘭根沖洗干凈，這樣前處理就結(jié)束。處理完后就可以用醋酸洋紅染色或改良苯酚品紅染色[4]。壓片/涂片后選取典型的染色體，在40倍物鏡及油鏡下顯微照相。

1.2.2 去壁低滲法 去壁低滲法也是把材料放0.1%秋水仙素溶液中進(jìn)行預(yù)處理處理8 h。然后前低滲即是將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中，在20~25℃條件下處理0.5h。接下來(lái)就是最關(guān)鍵的去壁，倒去KCI溶液，加入2.5%混合酶液，在25~30℃溫度下處理2~5 h左右。去壁后要進(jìn)行后低滲，使細(xì)胞完全脹，即是用20~30℃蒸餾水慢慢沖洗2~3次后，再將根尖放在0.075 tool/L KCI低滲液中處理。

4.試述農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化中外植體培養(yǎng)主要有哪些階段

1.種子消毒

成熟的水稻（Rice）種子去殼后放入無(wú)菌三角瓶中，用75%酒精浸泡1-2 min，無(wú)菌水沖洗2次；再用30% NaClO消毒30 min，其間需經(jīng)常搖動(dòng)，再用無(wú)菌水洗3-4次，用無(wú)菌濾紙吸干多余的水分，將種子接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上，每皿約30粒，于28℃暗培養(yǎng)。

2.繼代培養(yǎng)

經(jīng)過近1月的誘導(dǎo)，水稻（Rice）長(zhǎng)出黃色膨大的愈傷組織，去其盾片，將愈傷轉(zhuǎn)至新鮮的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L）上進(jìn)行繼代。每2周繼代一次，一般繼代2-4次即可獲得適合轉(zhuǎn)基因的嫩黃色、顆粒狀的胚性愈傷組織。在繼代培養(yǎng)2周后，挑選胚性顆粒用于遺傳轉(zhuǎn)化。

3.農(nóng)桿菌的培養(yǎng)

在轉(zhuǎn)化平板上挑取單菌落在1ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在50ml農(nóng)桿菌培養(yǎng)基（含相應(yīng)抗生素（antibiotic））中加入1ml上述培養(yǎng)物，200rpm,28℃培養(yǎng)5-6hr至OD600為0.6-1.0，培養(yǎng)結(jié)束前2hr加入乙酰丁香酮（AS，終濃度100uM）。取上述菌液在室溫下，4000rpm,10min，棄上清，加入MS液體培養(yǎng)基（含AS 100uM）重懸菌體，在與上相同的條件下培養(yǎng)2hr，使菌液的OD600=0.5左右，此時(shí)可用來(lái)轉(zhuǎn)化愈傷組織。

4.共培養(yǎng)

將水稻（Rice）胚性愈傷組織浸入農(nóng)桿菌菌液20-30min，再用無(wú)菌吸水紙吸干水分，將侵染的愈傷組織置于共培養(yǎng)培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + AS 100 uM）上，28℃暗培養(yǎng)三天。

5.洗菌

共培養(yǎng)的愈傷組織先用無(wú)菌水沖洗3遍，再浸泡在含Cef 250 mg/L的MS液體培養(yǎng)基中20-30min后，將愈傷組織轉(zhuǎn)入無(wú)菌濾紙上吸干。

6.選擇培養(yǎng)

將吸干水分的愈傷組織接種于選擇培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + Cef 250 mg/L）上。3周后，挑選新長(zhǎng)出的愈傷接種于選擇培養(yǎng)基（MS + 2,4-D 2.0 mg/L + Hyg 50 mg/L + Cef 250 mg/L）上，再選擇3周。

5.分化培養(yǎng)

將經(jīng)過2次選擇得到的抗性愈傷組織轉(zhuǎn)入到預(yù)分化培養(yǎng)基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 5 g/L + 麥芽糖30g/L）上暗培養(yǎng)10天左右，再轉(zhuǎn)到分化培養(yǎng)基（MS + KT 2.0 mg/L + NAA 0.2 mg/L + 6-BA 2.0 mg/L + Hyg 30 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 麥芽糖30 g/L）上光照培養(yǎng)。

7.生根培養(yǎng)

約1-2個(gè)月，將2cm左右高的幼苗轉(zhuǎn)到生根培養(yǎng)基（1/2MS + NAA 0.5 mg/L + Hyg 15 mg/L + phytagel 2.5 g/L + 蔗糖20g/L）上誘導(dǎo)不定根的發(fā)生。

8.轉(zhuǎn)基因苗的移栽

當(dāng)幼苗長(zhǎng)至10cm高時(shí)，將幼苗取出，用無(wú)菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。