細(xì)菌重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化(重組質(zhì)粒構(gòu)建的注意事項(xiàng))

1.重組質(zhì)粒構(gòu)建的注意事項(xiàng)

重組質(zhì)粒構(gòu)建是常用的分子生物學(xué)手段，其實(shí)只是最基本的方法，一般一個(gè)星期同時(shí)構(gòu)建三二個(gè)組質(zhì)粒是沒(méi)有問(wèn)題的。在國(guó)內(nèi)先進(jìn)的實(shí)驗(yàn)中，也大都是由實(shí)驗(yàn)員搞定。但是其中還是有些基本的技巧需要掌握。在這里將我的心得分享于大家，這也是我本人幾年來(lái)一線工作時(shí)的經(jīng)驗(yàn)積累，以期能為谷友提供借鑒，讓大家在實(shí)驗(yàn)中少走彎路。所涉及內(nèi)容如下：

1） 克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題

2） 載體酶切的問(wèn)題

3） 連接片段濃度比的問(wèn)題

在闡明上述問(wèn)題同時(shí)，本人盡可能舉些實(shí)驗(yàn)中的問(wèn)題案例予以說(shuō)明。

一、克隆基因的酶切位點(diǎn)問(wèn)題

1、克隆位點(diǎn)選擇的問(wèn)題。首先要對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行酶切位點(diǎn)掃描分析，列出其所含酶切位點(diǎn)清單。然后對(duì)照質(zhì)粒多克隆位點(diǎn)，所選擇的克隆位點(diǎn)必須是目標(biāo)基因所不含的酶切位點(diǎn)。這是常識(shí)，不贅述。

2、保護(hù)堿基數(shù)目的問(wèn)題。在設(shè)計(jì)PCR引物時(shí)，引入酶切位點(diǎn)后，常常要加入保護(hù)堿基，這是大家所熟知的。但是保護(hù)堿基數(shù)量多少，可能被新手所忽視。這種忽視碰可能會(huì)大大影響后續(xù)的實(shí)驗(yàn)進(jìn)展。

一般情況下，普通的內(nèi)切酶只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就可以正常進(jìn)行；而有一類，僅僅只加入兩個(gè)保護(hù)堿基，其內(nèi)切反應(yīng)就不能正常進(jìn)行，這是因?yàn)閮?nèi)切酶不能正常結(jié)合DN段上。如NdeI就屬這類，需要加入至少6個(gè)保護(hù)堿基，常用的HindIII也要三個(gè)。

2.關(guān)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

1.電擊轉(zhuǎn)化時(shí)通過(guò)瞬時(shí)高壓使細(xì)胞表面出現(xiàn)微小的孔洞，從而使外源DNA能通過(guò)孔洞進(jìn)入到細(xì)胞里面，一般適用于革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌或者真核微生物；

熱激轉(zhuǎn)化是使用鈣鹽或者鎂鹽溶液在低溫狀態(tài)下處理細(xì)胞使其處于感受態(tài)狀態(tài)，然后通過(guò)短時(shí)熱激使其吸入外源DNA片段，主要應(yīng)用于革蘭氏陰性細(xì)菌。

這些我想你應(yīng)該懂的。我就不贅述了。

2.大腸桿菌作為革蘭氏陰性細(xì)菌，使用一般的化學(xué)轉(zhuǎn)化即熱激轉(zhuǎn)化就可以了，為何要?jiǎng)谏褓M(fèi)力使用電轉(zhuǎn)化？轉(zhuǎn)化的目的不就是簡(jiǎn)單而方便為原則么？正所謂殺雞焉用牛刀？

希望我的回答對(duì)你有幫助。