蔗糖酶活力測定的(酶活力測定的注意事項有哪些)
1.酶活力測定的注意事項有哪些
注意事項：
1.底物濃度 除選擇適合的底物外，在實際應用中更多考慮的是底物濃度。由于[S]與反應速度V成雙曲線關系，在酶活性測定時，要求[S]達到一定水平以保證酶活性與酶量成正比。[S]范圍一般選擇在10~20Km為宜，此時反應速度基本達到最大反應速度，測定的誤差在可接受范圍。
2.酶濃度 在反應條件一定時，酶濃度與反應速度成正比。按照中間產物學說，只有[S]>>[E]時，酶才能被底物分子飽和，反應速度才能達到最大值。因此當標本酶活力過高時，應將標本適當稀釋后再加以測定。
3.溫度 不同的酶最適溫度可以不同，多數(shù)酶的最適溫度在37~40℃，高于或低于最適溫度，酶活性都降低。目前，酶活性的測定溫度尚未統(tǒng)一，但常規(guī)實驗室多使用37℃。溫度對酶促反應的影響程度通常用溫度系數(shù)（Q10）表示。溫度系數(shù)指溫度每升高10℃，化學反應速度增加的倍數(shù)。Q10通常為l~2。由溫度系數(shù)得知，溫度的變化對酶活性有著重要影響，因此要求酶活性測定要在恒溫條件下進行，溫度波動要控制在±1℃。
4.離子強度和pH值 在最適pH時，酶的活性最強，高于或低于最適pH，酶的活性都降低，多數(shù)酶的最適pH在5~8之間。在測定酶活性時，要求緩沖液具有足夠的緩沖容量，以便使pH值保持穩(wěn)定。血漿或血清標本含有多種緩沖溶質，具有較強的緩沖能力。為了防止血漿或血清標本緩沖溶質對反應液酸堿度的影響，使pH不致偏離設定值，標本用量不宜過大，血漿或血清標本體積/反應液體積≤1/10為宜。
5 輔助因子 某些金屬離子和維生素類輔酶是結合酶的輔助因子，例如Zn2+是羧基肽酶的輔基，Mo6+是黃嘌呤氧化酶的輔基，NADH是不需氧脫氫酶的輔酶。這些酶離開它們的輔基或輔酶就不能表現(xiàn)活性，因此在酶活性測定時，就要保證輔基或輔酶的供給。
6.激活劑 有些酶在有激活劑存在時才有活性或活性較高，例如Mg2+是肌酸激酶的激活劑，Cl-是淀粉酶的激活劑。因此在酶活性測定時，也要滿足酶對激活劑的需要。
7.抑制劑 酶的抑制可分為不可逆抑制和可逆抑制，后者又可分為競爭性抑制和非競爭性抑制。重金屬離子和砷化物對巰基酶的抑制、有機磷對羥基酶的抑制屬于不可逆抑制；丙二酸對琥珀酸脫氫酶的抑制、磺胺類藥物對二氫葉酸合成酶的抑制屬于競爭性抑制；哇巴因對Na+,K+-ATP酶的抑制屬于非競爭性抑制。抑制劑使酶活性降低，在測定酶活性時，應避免抑制劑的影響。
綜上所述，測定酶活性時，最適條件的選擇應該遵循最適底物濃度、最適溫度、最適pH值、滿足輔助因子和激活劑、避免抑制劑的原則。
2.測定酶活性時應注意些什么?
酶的活性測定要求有適宜的特定反應條件，應注意影響酶促反應速度的各種因素應該相對恒定。
1.酶的樣品應做適當?shù)奶幚怼?.反應體系中，底物的量足夠使酶被底物飽和，以充分反映待測酶的活力。
但過高的底物濃度可能抑制酶的活性，一般底物濃度在10km以上。3.測定代謝物時應保持酶的足夠濃度。
4.應根據反應時間選擇反應的最適溫度。5.根據不同的底物和緩沖液選擇反應的最適pH。
6.為獲取最高反應速度，在反應體系中應含有適宜的輔助因子，激活劑等。7.測定酶活性時應測定酶促反應的初速度。
3.用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活性的影響中水平實驗結果是什么意思
需要，舉例說明：正交實驗法舉例： 用正交法測定幾種因素對蔗糖酶活力的影響 目的要求 1.初步掌握正交實驗設計方法的使用 2.求出蔗糖酶的最適溫度和最適pH值 實驗原理 酶的催化作用是在一定條件下進行的，它受多種因素的影響，如：底物濃度、酶濃度、溶液的pH值和離子濃度、溫度、抑制劑和激活劑等都能影響催化反應的速度。
通常是在其他因素恒定的條件下，通過對某因素在一系列變化條件下的酶活性測定，求得該因素對酶活力的影響，這是單因素的簡單比較法。 本實驗用正交法測定溫度、pH值、底物濃度和酶濃度四種因素對蔗糖酶活性的影響，這是多因素（≥3）的實驗方法。
正交法是通過正交表安排多因素實驗，利用統(tǒng)計數(shù)學原理進行數(shù)據 分析的一種科學方法，它符合“以盡量少的試驗，獲得足夠的、有效的信 息”的實驗設計原則。正交試驗法的程序為下列八個步驟： （1）確定試驗目的。
實驗目的是多種多樣的，如找出產品質量指標的最佳組合、確定最佳工藝條件等。本實驗的目的是為了提高酶的反應速度，提高酶的活力。
（2）選擇質量特性指標。應選擇能提高或改進的質量特性及因素效應。
對于本實驗來說就是產物（葡萄糖）生成量的多少。 （3）選定相關因素。
即選擇和確定可能對實驗結果或質量特性值有影響的那些因素，可人為控制與調節(jié)的因素，如溫度、pH等。這些因素之間有相互獨立性。
（4）確定水平。水平，又稱位級，是因素的一個給定值或一種特定的措施，或一種特定的狀態(tài)。
水平也就是因素變化的各種狀態(tài)。在確定水平時，應考慮選擇范圍、水平數(shù)和水平位置。
如本實驗的溫度水平可以選擇20℃、30 ℃、50 ℃三個水平。 （5）選用正交表。
應從因素數(shù)、水平數(shù)以及有無重點因素需要強化考察等各方面綜合考慮選用正交表。一般情況下，首先根據水平數(shù)選用2或3系列表，然后，以容納試驗因素數(shù)，選用實驗次數(shù)最少的正交表。
如有重點考察的因素，則根據其多考察的水平數(shù)，選混合型正交表。 （6）配列因素水平，制定實驗方案。
按隨機原則，把因素配列于選用的正交表中，制定實驗的順序、時間等，即制定實驗具體方案。 （7）實施實驗方案。
按實驗方案，認真、正確地試驗，如實記錄各種實驗數(shù)據。 （8）實驗結果分析。
對實驗中取得的各種數(shù)據進行分析。如從數(shù)據中直接選出符合或接近質量特性期望值的實驗條件組。
如不能采用直觀分析方法，則應采用其他分析方法，確定各因素主次地位可用極差分析方法，定量分析各個因素對實驗結果的影響程度，則用方差分析方法。 操作方法 1.實驗設計： 1）確定指標：即實驗的結果。
本實驗的指標是酶活力。這里，用A520值表示。
2）制定因素水平表：考察四個因素（溫度、pH值、底物濃度和酶濃度），每個因素取三個水平（如溫度選擇20℃、35 ℃ 和50 ℃ 三個水平）。水平是因素變化的范圍（通常是根據專業(yè)知識確定。
如無資料可借鑒，應先加寬范圍再逐步縮小）內要進行實驗的具體條件，如表1。 表1 因素水平表 3）選擇正交表：可容納三因素三水平的正交表有L9(34)、L27(313)、L18(36*6)和L27(38*9)。
本實驗不考察各因素間的交互作用，也沒設計混合水平，只有水平數(shù)均為3的的四個因素，故選用L9(34)表，見表2。 分析： A. 判斷各因素的水平范圍是否選偏； B. 判斷各因素顯著性大小的順序； C. 判斷實驗結果的置信度。
實驗安排 具體操作步驟： 1、將已配制好的三種不同pH的0.2mol/L的緩沖液于試管中。 2、將酶粉用蒸餾水溶解（適當體積10-30ml不等），離心去 除不溶物，10,000rpm/min,10min,4℃。
3、酶活預示實驗，確定酶的稀釋倍數(shù)。（可根據產物稀釋的 倍數(shù)來確定酶的稀釋倍數(shù)）A520在0.4-2.0之間即可。
4、準備10支試管。其中一支為“0”號管，作為測量時的參 比溶液。
其他九支試管根據前面的圖表3加入相關的溶 液，分別在不同的條件下進行酶反應。利用二硝基水楊酸 的方法測定不同管在A520下的光密度值。
5、計算同一因素不同水平的級差，級差小代表離散度小， 表示該水平為酶反應的最適條件。 1）數(shù)據記錄：將上述兩組平行實驗的結果取平均值后的9個數(shù)據，填入表4中的Yi項內。
2）數(shù)據整理及分析：對于一般的實驗，可用極差分析，該分析方法簡單、直觀。對要求精細的實驗，則要用方差分析，該方法可給出誤差的大小估計，但有一定的計算量。
對于有混合水平的正交實驗，只能用方差分析。
4.影響酶活性的因素實驗應注意什么
(1)酶促反應過程中，只有最初一段時間內反應速度與酶濃度成正比，隨著反應時間的延長，反應速度即逐漸降低。
(2)要規(guī)定一定的反應條件，如時間、溫度、pH等，并在酶測定過程中保持這些反應條件的恒定，如溫度不得超過規(guī)定溫度的士1℃，pH應恒定。
(3)配制的底物濃度應準確且足夠大，底物液中應加入不抑制該酶活力的防腐劑并保存于冰箱中，以防止底物被分解。
(4)標本要新鮮，由于絕大多數(shù)酶可因久置而活力降低，標本如無法及時測定，應保存于冰箱中。用血漿時，應考慮到抗凝劑對酶反應的影響。有些酶在血細胞、血小板中的濃度比血清高，為此在采血、分離血清時，應注意防止溶血和白細胞的破裂。
(5)在測定過程中，所用儀器應絕對清潔，不應含有酶的抑制物，如酸、堿、蛋白沉淀劑等。
