小提質(zhì)粒(在質(zhì)粒DNA的提取過程中,應(yīng)注意哪些操作,為什么?)
1.在質(zhì)粒DNA的提取過程中,應(yīng)注意哪些操作,為什么?
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認(rèn)真看。質(zhì)粒提取需要注意的提到了。
溶液I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0； 溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III,3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 讓我們先來看看溶液I的作用。
任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實對質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒有任何影響。所以說溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價金屬離子都螯合掉。
如果不加EDTA，其實也沒什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長的時間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會迅速被降解，因為最終溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實話告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來懸浮菌體就可以了。
有一點不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液II了。
這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無非是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。
很多人不知道其實破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳 的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細(xì)胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。
用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。
很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。
這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，千萬不要這時候去接電話，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對待女孩子一樣），不然基因組DNA也會斷裂?；蚪MDNA的斷裂會帶來麻煩，后面我再詳細(xì)說明。
每個人都知道，溶液III加入后就會有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。
如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。
如果在溶液II中不加SDS會怎樣呢，也會有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會不會是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會產(chǎn)生沉淀的。
因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。
這其實是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來，溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。
大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個氨基酸上結(jié)合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。
那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。
所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復(fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復(fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本來是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。
不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的。
2.如何提質(zhì)粒
方法一：試劑盒 速度快純度高污染小?？梢再I回來看說明書。
方法二：人工提取 比較復(fù)雜污染相對高。但是便宜且隨時可以操作。簡述如下：
1. 接菌。將適量菌體接入含有相同抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過夜。
2. 將菌液4000r/min離心1min，棄掉上清
3. 加150微溶液1懸浮細(xì)胞，靜置10分鐘
4. 加200微溶液2（必須新鮮配制），輕輕混勻，至液體清亮。
5. 上步操作5min之內(nèi)加入溶液3，混勻。冰上15min。
6. 12000r/min離心10min，小心吸出上清轉(zhuǎn)移到另一個小指管中。棄掉沉淀的蛋白。
7. 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），漩渦混勻，12000r/min離心5min，上清轉(zhuǎn)移到另一小指管。
8. 加等體積氯仿：異戊醇（24:1），漩渦混勻，12000r/min離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另一小指管。
9. 上清中加2倍體積無水乙醇，混勻后室溫30min。12000r/min離心10min，吸去上清。
10. 用1ml的70%乙醇洗滌沉淀2次（每次12000r/min離心5min）。吸去上清后，烘干或者空轉(zhuǎn)，直至沉淀透明
11. 加20微的RTE（含有RNA酶的TE緩沖液，沒有的話無菌水也可以），溶解質(zhì)粒DNA,-20℃保存。
呼呼手打好累。溶液123的配方網(wǎng)上應(yīng)該都有的吧。沒有我再給你打。另外我們一般不圖純度的話，不用什么酚氯仿異戊醇的，直接用70%乙醇洗兩次也可以，感覺沒太大影響。
