小提質(zhì)粒(在質(zhì)粒DNA的提取過(guò)程中,應(yīng)注意哪些操作,為什么?)
1.在質(zhì)粒DNA的提取過(guò)程中,應(yīng)注意哪些操作,為什么?
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認(rèn)真看。質(zhì)粒提取需要注意的提到了。
溶液I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0； 溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III,3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 讓我們先來(lái)看看溶液I的作用。
任何生物化學(xué)反應(yīng)，首先要控制好溶液的pH，因此用適當(dāng)濃度的和適當(dāng)pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過(guò)的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說(shuō)起來(lái)不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大腸桿菌不會(huì)快速沉積到管子的底部。
因此，如果溶液I中缺了葡萄糖其實(shí)對(duì)質(zhì)粒的抽提本身而言，幾乎沒(méi)有任何影響。所以說(shuō)溶液I中葡萄糖是可缺的。
那么EDTA呢？大家知道EDTA是Ca2+和Mg2+等二價(jià)金屬離子的螯合劑，配在分子生物學(xué)試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長(zhǎng)。在溶液I中加入高達(dá) 10 mM 的EDTA，無(wú)非就是要把大腸桿菌細(xì)胞中的所有二價(jià)金屬離子都螯合掉。
如果不加EDTA，其實(shí)也沒(méi)什么大不了的，只要不磨洋工，只要是在不太長(zhǎng)的時(shí)間里完成質(zhì)粒抽提，就不用怕DNA會(huì)迅速被降解，因?yàn)樽罱K溶解質(zhì)粒的TE緩沖液中有EDTA。如果哪天你手上正好缺了溶液I，可不可以抽提質(zhì)粒呢？實(shí)話(huà)告訴你，只要用等體積的水，或LB培養(yǎng)基來(lái)懸浮菌體就可以了。
有一點(diǎn)不能忘的是，菌體一定要懸浮均勻，不能有結(jié)塊。 輪到溶液II了。
這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2%的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，無(wú)非是為了保證NaOH沒(méi)有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。
很多人不知道其實(shí)破細(xì)胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實(shí)上NaOH是最佳 的溶解細(xì)胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，碰到了堿都會(huì)幾乎在瞬間就溶解，這是由于細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化所導(dǎo)致。
用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無(wú)法有效溶解大腸桿菌（不妨可以自己試一下），自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當(dāng)然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因?yàn)镾DS也是堿性的，只是弱了點(diǎn)而已。
很多人對(duì)NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒(méi)有正確理解一些書(shū)上的有關(guān)DNA變性復(fù)性的描述所導(dǎo)致。有人不禁要問(wèn)，既然是NaOH溶解的細(xì)胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。
這一步要記住兩點(diǎn)：第一，時(shí)間不能過(guò)長(zhǎng)，千萬(wàn)不要這時(shí)候去接電話(huà)，因?yàn)樵谶@樣的堿性條件下基因組DNA片斷會(huì)慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合（象對(duì)待女孩子一樣），不然基因組DNA也會(huì)斷裂?；蚪MDNA的斷裂會(huì)帶來(lái)麻煩，后面我再詳細(xì)說(shuō)明。
每個(gè)人都知道，溶液III加入后就會(huì)有大量的沉淀，但大部分人卻不明白這沉淀的本質(zhì)。最容易產(chǎn)生的誤解是，當(dāng)SDS碰到酸性后發(fā)生的沉淀。
如果你這樣懷疑，往1%的SDS溶液中加如2M的醋酸溶液看看就知道不是這么回事了。大量沉淀的出現(xiàn)，顯然與SDS的加入有關(guān)系。
如果在溶液II中不加SDS會(huì)怎樣呢，也會(huì)有少量的沉淀，但量上要少得多，顯然是鹽析和酸變性沉淀出來(lái)的蛋白質(zhì)。既然SDS不是遇酸發(fā)生的沉淀，那會(huì)不會(huì)是遇鹽發(fā)生的沉淀呢？在1%的SDS溶液中慢慢加入5 N的NaCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)SDS在高鹽濃度下是會(huì)產(chǎn)生沉淀的。
因此高濃度的鹽導(dǎo)致了SDS的沉淀。但如果你加入的不是NaCl而是KCl，你會(huì)發(fā)現(xiàn)沉淀的量要多的多。
這其實(shí)是十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。如此看來(lái)，溶液III加入后的沉淀實(shí)際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。
大家知道SDS專(zhuān)門(mén)喜歡和蛋白質(zhì)結(jié)合，平均兩個(gè)氨基酸上結(jié)合一個(gè)SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉淀了。這個(gè)過(guò)程不難想象，因?yàn)榛蚪MDNA太長(zhǎng)了，長(zhǎng)長(zhǎng)的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結(jié)合。
那么2 M的醋酸又是為什么而加的呢？是為了中和NaOH，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的堿性條件會(huì)打斷DNA，所以要中和之?；蚪MDNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50-100 kb大小的片斷，就沒(méi)有辦法再被PDS共沉淀了。
所以堿處理的時(shí)間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會(huì)有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認(rèn)為是溶液III加入后基因組DNA無(wú)法快速?gòu)?fù)性就被沉淀了，這是天大的誤會(huì)，因?yàn)樽冃缘囊埠脧?fù)性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。
NaOH本來(lái)是為了溶解細(xì)胞而用的，DNA分子的變性其實(shí)是個(gè)副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來(lái)其實(shí)沒(méi)有關(guān)系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點(diǎn)。
不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實(shí)還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進(jìn)行抽提，然后進(jìn)行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時(shí)間一長(zhǎng)就會(huì)因?yàn)榛烊氲腄Nase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個(gè)全面的。
2.如何提質(zhì)粒
方法一：試劑盒 速度快純度高污染小。可以買(mǎi)回來(lái)看說(shuō)明書(shū)。
方法二：人工提取 比較復(fù)雜污染相對(duì)高。但是便宜且隨時(shí)可以操作。簡(jiǎn)述如下：
1. 接菌。將適量菌體接入含有相同抗性的LB培養(yǎng)基中，37°C搖床培養(yǎng)過(guò)夜。
2. 將菌液4000r/min離心1min，棄掉上清
3. 加150微溶液1懸浮細(xì)胞，靜置10分鐘
4. 加200微溶液2（必須新鮮配制），輕輕混勻，至液體清亮。
5. 上步操作5min之內(nèi)加入溶液3，混勻。冰上15min。
6. 12000r/min離心10min，小心吸出上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)小指管中。棄掉沉淀的蛋白。
7. 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25:24:1），漩渦混勻，12000r/min離心5min，上清轉(zhuǎn)移到另一小指管。
8. 加等體積氯仿：異戊醇（24:1），漩渦混勻，12000r/min離心10min，上清轉(zhuǎn)移到另一小指管。
9. 上清中加2倍體積無(wú)水乙醇，混勻后室溫30min。12000r/min離心10min，吸去上清。
10. 用1ml的70%乙醇洗滌沉淀2次（每次12000r/min離心5min）。吸去上清后，烘干或者空轉(zhuǎn)，直至沉淀透明
11. 加20微的RTE（含有RNA酶的TE緩沖液，沒(méi)有的話(huà)無(wú)菌水也可以），溶解質(zhì)粒DNA,-20℃保存。
呼呼手打好累。溶液123的配方網(wǎng)上應(yīng)該都有的吧。沒(méi)有我再給你打。另外我們一般不圖純度的話(huà)，不用什么酚氯仿異戊醇的，直接用70%乙醇洗兩次也可以，感覺(jué)沒(méi)太大影響。
