pcr檢查(PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)有哪些)
1.PCR實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)有哪些
1、必須在無菌無塵環(huán)境下進(jìn)行操作；
2、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書；
3、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室；
4、后PCR區(qū)PCR完成以后，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。
擴(kuò)展資料
PCR實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)：
1、靈敏度高：PCR實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。
2、簡便、快速：PCR實(shí)驗(yàn)反應(yīng)一般在2~4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板。可直接用臨床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。
參考資料來源：百度百科-PCR實(shí)驗(yàn)室
2.PCR實(shí)驗(yàn)過程中的注意事項(xiàng)
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。
PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。
酶切分析： 根據(jù)PCR產(chǎn)物中限制性內(nèi)切酶的位點(diǎn)，用相應(yīng)的酶切、電泳分離后，獲得符合理論的片段，此法既能進(jìn)行產(chǎn)物的鑒定，又能對靶基因分型，還能進(jìn)行變異性研究。 分子雜交：分子雜交是檢測PCR產(chǎn)物特異性的有力證據(jù)，也是檢測PCR 產(chǎn)物堿基突變的有效方法。
Southern印跡雜交： 在兩引物之間另合成一條寡核苷酸鏈（內(nèi)部寡核苷酸）標(biāo)記后做探針，與PCR產(chǎn)物雜交。此法既可作特異性鑒定，又可以提高檢測PCR產(chǎn)物的靈敏度，還可知其分子量及條帶形狀，主要用于科研。
斑點(diǎn)雜交： 將PCR產(chǎn)物點(diǎn)在硝酸纖維素膜或尼膜薄膜上，再用內(nèi)部寡核苷酸探針雜交，觀察有無著色斑點(diǎn)，主要用于PCR產(chǎn)物特異性鑒定及變異分析。 氯仿抽提掉蛋白質(zhì)和其它細(xì)胞組份，用乙醇或異丙醇沉淀 核酸。
提取的核酸即可作為模板用于PCR反應(yīng)。一般臨床檢測標(biāo)本，可采用快速簡便的方法溶解細(xì)胞，裂解病原體，消化除去染色體的蛋白質(zhì)使靶基因游離，直接用于PCR擴(kuò)增。
RNA模板提取一般采用異硫氰酸胍或蛋白酶K法，要防止RNase降解RNA。 溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點(diǎn)。
在標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)中采用三溫度點(diǎn)法，雙鏈DNA在90~95℃變性，再迅速冷卻至40 ~60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70~75℃，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因（長度為100~300bp時）可采用二溫度點(diǎn)法， 除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性，65℃左右退火與延伸（此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性）。
實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng) 盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。
若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4. 操作多份樣品時，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6. 操作時設(shè)立陰陽性對照和空白對照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)； 8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。
3.在做pcr的操作過程中需注意哪些問題?
首先，在設(shè)計PCR引物時，結(jié)構(gòu)要好，長度應(yīng)在20bp左右，避免引物間形成引物二聚體。
兩條引物的退火溫度盡量保持一致，最好是在55度左右。其次，使用的DNA模板量是比較關(guān)鍵的，應(yīng)使用純度較高，基因組較完全，沒有產(chǎn)生斷鏈的基因組DNA。
然后是PCR體系中各個試劑的使用，比如說酶的純度，活性，并且要注意酶量一定要適中，過尤不及。各DNTP的量要保持一致。
PCRbuffer中要注意有無添加鎂離子等幫助反應(yīng)進(jìn)行的東西。等等。
最后是PCR程序的設(shè)置。如果怕一開始就使用一個固定的退火溫度擴(kuò)增不出來，可以先小批量得試驗(yàn)溫度梯度，或者用touchdown程序，即先設(shè)置一個較高的退火溫度，這樣引物的特異性結(jié)合會比較好，然后每個循環(huán)的退火溫度都比上個循環(huán)低0.5度或1度，最終停留在某一個較合適的溫度完成整個程序。
PCR反應(yīng)中有太多細(xì)節(jié)要注意了。只能在試驗(yàn)中摸索，進(jìn)步。
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4.PCR擴(kuò)增需要注意的點(diǎn)
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補(bǔ)序列；引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計時可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗(yàn)活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實(shí)驗(yàn)室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴(kuò)增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。
6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個工作區(qū)的獨(dú)立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實(shí)驗(yàn)的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實(shí)驗(yàn)；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時必須戴手套；⑦實(shí)驗(yàn)前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
5.PCR的操作注意事項(xiàng)
PCR操作注意事項(xiàng)：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進(jìn)RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。
2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機(jī)，2600*g離心30-60分鐘。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1*106細(xì)胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細(xì)胞8-15μg，成纖維細(xì)胞5-7μg
6.進(jìn)行PCR實(shí)驗(yàn)時應(yīng)注意哪些事項(xiàng)
首先，要確定你的模板DNA的濃度大概是多少，太稀和太濃都影響PCR結(jié)果，具體數(shù)據(jù)不記得了，只是我自己跑PCR時因?yàn)闈舛葐栴}失敗了很多次，通過多次調(diào)整濃度才得到較理想的結(jié)果。
其次，如果是自己提的DNA，要確保模板中沒有酒精（提DNA最后一步，一定要等酒精揮發(fā)完才能加TE）
最重要的是要探索一個好的退火溫度，退火溫度的高低可以以0.5℃的梯度變化確定，假如參考值為61℃，先跑一次，看結(jié)果，如果拖尾很長，則一個一個梯度增加退火溫度，但不能增得太急，我那時次增加5℃，結(jié)果跑出來全是很小很小的片段，大概都只有300bp了。
這是我跑PCR的一些經(jīng)驗(yàn)，僅供參考
7.PCR操作時注意事項(xiàng)
1. PCR引物設(shè)計： 引物設(shè)計可能是PCR擴(kuò)增成功最關(guān)鍵的因素。
如引物設(shè)計欠佳，可能導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不足，甚至擴(kuò)增失敗，其原因是設(shè)計欠佳的引物可導(dǎo)致非特異擴(kuò)增和/或形成引物二聚體，此又成為PCR反應(yīng)的競爭性產(chǎn)物，從而進(jìn)一步抑制PCR產(chǎn)物形成。 在引物設(shè)計時必須考慮以下幾個因素，其中最重要的是引物長度、溶解溫度（Tm）、特異性、引物序列互補(bǔ)問題、G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸、3'-末端序列等。
（1）引物長度：由于PCR反應(yīng)的特異性、退火溫度以及時間均至少部分與PCR引物長度相關(guān)聯(lián)，因此引物長度是PCR擴(kuò)增是否成功關(guān)鍵的因素。一般PCR引物長度為15-30核苷酸。
（2）溶解溫度（Tm）：因加熱而斷開H鍵，使雙鏈DNA分開或“溶解”為單鏈DNA。溶解溫度（Tm）即指使一半雙鏈DNA變?yōu)閱捂淒NA的溫度。
Tm可采用下列公式計算：Tm=2(A+T) + 4(G+C)。 需注意PCR反應(yīng)至少有兩個（一對）引物，兩個寡核苷酸引物Tm 值應(yīng)比較接近，不可差異過大。
因有較高的Tm值的引物在較低的反應(yīng)溫度時可發(fā)生錯配，而引物Tm值較低，反應(yīng)溫度較高時則可能不能發(fā)生作用，因此如引物的Tm值差異較大，可導(dǎo)致PCR擴(kuò)增效率低下甚至擴(kuò)增失敗。 （3）引物序列互補(bǔ)：設(shè)計引物時應(yīng)絕對沒有3個堿基以上的內(nèi)引物配對，如引物有這樣具有自我配對的區(qū)域，“彈回”即部分雙鏈結(jié)構(gòu)將發(fā)生在退火反應(yīng)時。
（4）G/C 含量和多嘧啶（T,C） 或多嘌呤（A, G）延伸：待選擇的引物序列應(yīng)盡可能是堿基隨意分布，G+C含量平均-避免長A+T和富含G+C的區(qū)域。在引物的堿基組成中GC含量一般為45%-55%。
在選擇的引物序列中應(yīng)沒有多G 或多C延伸，因其可促進(jìn)非特異性退火，多A 和多T延伸也應(yīng)避免，因其可“呼吸”和使引物-模板復(fù)合物展開延伸，降低擴(kuò)增的效率。同時多嘧啶（T,C）和多嘌呤（A,G）延伸也應(yīng)被避免。
（5）3'-末端序列：為控制引物錯配，應(yīng)認(rèn)真地確定PCR引物中3'末端的位置。 總而言之，應(yīng)重視PCR引物設(shè)計，設(shè)計PCR引物時應(yīng)認(rèn)真小心。
對于一個成功的PCR來說，幾個重要因素如引物長度、GC含量和3'序列必須優(yōu)化。理想的引物應(yīng)為差不多隨意分布的核苷酸混合、GC含量50%、長度約為20個堿基，因此能使Tm值處于56-62oC范圍。
分析靶基因潛在引物位點(diǎn)時，應(yīng)考慮無單聚合體， 沒有明顯的二級結(jié)構(gòu)形成的傾向，不自我互補(bǔ)，與其他雙鏈靶基因序列沒有明顯的同源性。為避免枯燥無味的設(shè)計，節(jié)省時間，減少錯誤，可應(yīng)用計算機(jī)程序優(yōu)化設(shè)計、選擇、確定寡核苷酸引物。
