elisa血清稀釋(ELISA實驗的操作注意事項有哪些)
1.ELISA實驗的操作注意事項有哪些
1.儲存.
收到試劑盒后應盡快放入冷藏室內(nèi)保存，保存溫度為4℃-8℃.
2.回溫.
試劑盒在使用前應于室溫（22-27℃）下充分回溫，回溫時間為40-60分鐘.回溫過程中勿將酶標板的包裝袋開封，回溫結(jié)束后再將其從包裝袋中取出使用.
3.樣品稀釋.
樣品稀釋應嚴格按照說明書要求的稀釋倍數(shù)進行稀釋.如稀釋倍數(shù)過大，可采用多步法進行樣品稀釋.例如：試劑盒要求樣品需進行500倍稀釋，可吸取5μl樣品加入245μl樣品稀釋液中，充分混勻后，再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可.
4.加樣.
稀釋好的樣品在加入酶標板進行孵育的過程中，盡可能縮短第一次加樣和最后一次加樣的時間間隔，樣品加好后馬上開始計時.
5.洗板.
樣品孵育時間結(jié)束后，馬上甩去孔內(nèi)液體.如多塊酶標板需同時洗滌，可先將板內(nèi)液體甩去，倒扣于吸水紙上，再依次進行洗滌.使用洗板機洗滌時，建議洗滌次數(shù)增加一次.未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月.
6.顯色.
底物藥片可在顯色前3-5分鐘加入底物緩沖液中，混合直到完全溶解.本試劑最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周.
7.終止及讀數(shù).
提前打開酶標儀，加入終止液后立即讀數(shù).
8.同批號試劑盒中的試劑，除酶標二抗及陽性對照外，其余均可通用.
9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對.
10.實驗室管理
桌面保持整潔，插槍頭戴手套等.
2.ELISA 實驗注意事項知多少
？優(yōu)質(zhì)的試劑，良好的儀器和正確的操作是保證ELISA檢測結(jié)果準確可靠的必要條件。
ELISA的操作因固相載體的形成不同而有所差異，國內(nèi)醫(yī)學檢驗一般均用板式。本文將敘述板式ELISA各個操作步驟的注意要點（珠式、管式及磁性球ELSIA，國外試劑均與特殊儀器配合應用，兩者均有詳細的使用說明，須嚴格遵照規(guī)程操作）。
標本的采取和保存 通常我們可用于ELISA檢測的樣本是有多種類型的，如血清、血漿、尿液、細胞培養(yǎng)上清或組織勻漿液等，不同類型的檢測樣本前期的處理方法是不一樣的。正確的處理樣本是保證ELISA檢測的正確性和準確性的第一步，下面簡單介紹一下不同類型的樣本的處理方法。
血清 血清是最常用于ELISA檢測的一類樣本，處理也比較簡單。 用無熱原、無內(nèi)毒素的試管或離心管采集血液標本，將試管或離心管室溫放置2小時或4℃過夜，使血清析出。
（最好將試管或離心管傾斜放置，使液面橫截面增大，能使血清更大程度的析出。）4℃1000*g離心20min，仔細收集上清。
建議將血清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。 采血過程中應避免溶血，因為紅細胞裂解時會釋放具有過氧化酶活性的物質(zhì)，在以HRP為標記的ELISA檢測中會有非特異性的顯色，而導致檢測的不準確性。
同時也應避免細菌污染，因為菌體內(nèi)可能含有內(nèi)源性的HRP從而導致檢測的假陽性。 血漿 用含抗凝劑的采血管或離心管采集血液標本，標本采集后30min內(nèi)4℃1000*g離心15min，取上清即血漿。
將上清分裝多份，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。避免使用溶血或高血脂的標本。
常用的抗凝劑為EDTA、肝素鈉和枸櫞酸鈉等，檢測時還應仔細閱讀試劑盒說明書，檢查試劑盒是否對抗凝劑有特殊要求。 細胞培養(yǎng)上清 取細胞培養(yǎng)上清到離心管，1000*g離心20min，除去細胞碎片及雜質(zhì)，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。
細胞裂解液 1） 吸去培養(yǎng)板內(nèi)的培養(yǎng)基，用胰酶消化細胞，加適量培養(yǎng)基將細胞從培養(yǎng)板上吹下來。懸浮細胞可省略。
2） 收集細胞懸液，1000*g離心10min，棄去培養(yǎng)基，用預冷的PBS潤洗3次。 3） 加入適量的預冷PBS或細胞裂解液（臨用前加入蛋白酶抑制劑）重懸細胞。
通常6孔板一個孔的細胞量需要150~250μL PBS重懸。 4） 將樣品放入-20℃或-80℃，使樣品冷凍，再放室溫解凍樣品，反復凍融幾次，使細胞充分裂解。
也可將樣品進行超聲破碎，以達到裂解的目的。 5) 4℃10000*g 離心10min，除去細胞碎片，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。
組織勻漿液 1） 將組織樣本用PBS (0.01M, PH 7.4) 沖洗，洗去組織表面殘留的血液或雜質(zhì)。 2） 將組織塊稱重，記錄后剪碎，碎塊應盡量小，便于勻漿得更充分。
3） 將組織按一定的比例加入預冷的PBS（臨用前加入蛋白酶抑制劑）勻漿，勻漿時置于冰上或冰浴中。（通常按組織重量：PBS體積=1:9的比例勻漿，例如1g的組織樣本對應9mL的PBS，具體體積可根據(jù)實驗需要適當調(diào)整，檢測后計算樣品濃度時應乘以相應的稀釋倍數(shù)）。
4） 吸取勻漿液到離心管，4℃5000*g 離心5~10min，取上清，-20℃或-80℃保存，避免反復凍融。 尿液、唾液等其他液體生物樣本 1000*g離心20min，取上清即可檢測。
總的來說，因為ELISA只能檢測可溶性蛋白的含量，所以應保證所有樣本均為澄清的液體，沉淀或懸浮物都應離心去除。 為了保證檢測的準確性，保存于-20℃或-80℃的樣本最好在1~6個月內(nèi)檢測；4℃保存的樣本應在1周內(nèi)進行檢測。
另外，還應保證樣本不含NaN3，因為NaN3會抑制HRP的活性，從而導致假陰性的結(jié)果。 試劑的準備 按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑。
ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的，應為新鮮的和高質(zhì)量的。自配的緩沖液、洗滌液應用pH計測量。
從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用，一般室溫平衡不低于30min。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存。
加樣 在ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應將所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。
加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中。每次加標本應更換吸嘴，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣（一般不建議使用）。
有些指標檢測（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本，然后在微型震蕩器上震蕩1min。
加酶結(jié)合物工作液和底物工作液時可用多道移液器，使加液過程在最短時間內(nèi)完成。 保溫 在ELISA中一般有兩次抗原抗體反應，即加標本和加酶結(jié)合物后。
抗原抗體反應的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育。 ELISA屬固相免疫測定，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生。
以抗體包被的夾心法為例，加入板孔中的標本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸。這是一個逐步平衡的過程，因此需。
3.怎樣正確溶解與稀釋ELISA標準品
ELISA標準曲線是結(jié)果計算的尺子，標準品是ELISA 實驗成功與否的關鍵點。怎樣正確溶解、稀釋標準品呢？
1. 粉末標準品短暫離心，讓因運輸沾到管蓋、管壁的標準品沉到管底。
2. 根據(jù)瓶標簽加入一定體積的蒸餾水，加水后輕柔渦旋震蕩，室溫靜置溶解 10-30min，讓粉末完全溶解。
注意：加水后暫不用移液槍吹吸，避免蛋白未溶解，槍頭帶出部分蛋白，待完全溶解后可吹吸或渦旋振蕩混勻。
3. 標準品梯度稀釋：
(1)標準品稀釋液的選擇：
若血清、血漿、組織勻漿樣本，用試劑盒中的標準品稀釋液，梯度稀釋標準品。
若細胞上清樣本，建議用細胞培養(yǎng)基梯度稀釋標準品。
(2)耗材準備：準備8個1.5Ml離心管，寫上S1-S7、空白。
(3)梯度稀釋：根據(jù)說明書，每管加入等體積的標準品稀釋液（培養(yǎng)基）。吸取同體積溶解好的標準品到S1管中，吹打10次混勻，渦旋5S。從S1管中吸取同體積溶液到 S2管，吹打10次混勻，渦旋5s。同法稀釋S3-S7濃度。
(4)空白： 標準品稀釋液（培養(yǎng)基）作為空白即零濃度。
注意：梯度稀釋標準品時，渦旋震蕩混勻后可短暫離心，讓到蓋子、壁上的液體到管底，再開始稀釋下個濃度。
標準品溶解、梯度稀釋是ELISA實驗關鍵點，按以上方法梯度稀釋即可。
4.elisa 實驗操作過程中有哪些注意事項
注意事項：
1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。
2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
3.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
4.請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)（*n*5）。
5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
6.底物請避光保存。
7.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準。
8.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
9.不同批號組分不得混用。
5.做elisa實驗需要注意哪些問題?
Elisa實驗中應該注意的問題，包括樣品稀釋、試劑盒平衡、樣品和試劑的混勻、加樣、溫育等問題，希望對你有用處。
Elisa試劑盒有著準確性高、靈敏度高、特異性強的諸多優(yōu)點，深受廣大用戶朋友的喜愛。然而，在實驗過程中，也需要注意很多問題。對此，武漢福來生物工程提醒你，需要遵守一些規(guī)則，才能更好地進行實驗，取得較好的實驗成果。
Elisa方法被廣泛應用于各種抗原和抗體測定。在Elisa測定中影響因素較多，在檢測過程中除正常反應外，有時常見到一些錯誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：標本因素；試劑因素；操作因素。
1.樣品稀釋
一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗確定，以保證試驗的靈敏度和特異性。酶聯(lián)免疫反應是一種敏感性很高的反應，如果血清不稀釋，不可避免會產(chǎn)生很強的非特異性反應，出現(xiàn)假陽性。
2.試劑盒平衡
Elisa中所有試劑和板條均應在試驗前平衡至室溫（約25℃），一般需在室溫放置20~30分鐘以上。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應不夠充分。冬季室溫低，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3.樣品和試劑的混勻
在稀釋前、后的樣品必須充分混勻，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性。
4.加樣
加樣是一項很重要的步驟。加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導致非特異吸附。
5.溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關鍵的一個因素。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應在固相上進行，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原完全結(jié)合，必須在一定的溫度條件下反應一定的時間。
6.洗板
固相免疫測定技術是一種非均相免疫測定技術，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應溫育過程中吸附的非特異成份分離開來，以保證ELISA測定的特異性。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘，甩去板孔中洗液后，一定要大力拍干；及時更換吸水紙，尤其是拍過酶標記物的吸水紙一定要棄去，否則可能影響試驗結(jié)果。
7.顯色
顯色一定要控制時間，根據(jù)試劑盒說明操作即可。一般來說，顯色時間過短，結(jié)果偏低；顯色時間過長，空白增高或者非特異性顯色增加。
8.比色
比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以OPD為底物的試劑盒均有使用，而前者比色波長為450nm，后者為492nm，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題。
6.ELISA實驗操作中注意事項有哪些啊
1.儲存。
收到試劑盒后應盡快放入冷藏室內(nèi)保存，保存溫度為4℃-8℃。2.回溫。
試劑盒在使用前應于室溫（22-27℃）下充分回溫，回溫時間為40-60分鐘?；販剡^程中勿將酶標板的包裝袋開封，回溫結(jié)束后再將其從包裝袋中取出使用。
3.樣品稀釋。樣品稀釋應嚴格按照說明書要求的稀釋倍數(shù)進行稀釋。
如稀釋倍數(shù)過大，可采用多步法進行樣品稀釋。例如：試劑盒要求樣品需進行500倍稀釋，可吸取5μl樣品加入245μl樣品稀釋液中，充分混勻后，再吸取10μl混合液加入90μl樣品稀釋液中即可。
4.加樣。稀釋好的樣品在加入酶標板進行孵育的過程中，盡可能縮短第一次加樣和最后一次加樣的時間間隔，樣品加好后馬上開始計時。
5.洗板。樣品孵育時間結(jié)束后，馬上甩去孔內(nèi)液體。
如多塊酶標板需同時洗滌，可先將板內(nèi)液體甩去，倒扣于吸水紙上，再依次進行洗滌。使用洗板機洗滌時，建議洗滌次數(shù)增加一次。
未用完的洗滌液可在4℃-8℃下密封保存1月。6.顯色。
底物藥片可在顯色前3-5分鐘加入底物緩沖液中，混合直到完全溶解。本試劑最好是現(xiàn)用現(xiàn)配，未用完的底物溶液可在4℃-8℃下避光保存1周。
7.終止及讀數(shù)。提前打開酶標儀，加入終止液后立即讀數(shù)。
8.同批號試劑盒中的試劑，除酶標二抗及陽性對照外，其余均可通用。9.移液器的正確使用、保存、清潔、校對。
10.實驗室管理 桌面保持整潔，插槍頭戴手套等。
