浸漬法:浸漬法是將原料用適當?shù)娜軇┰诔鼗驕責釛l件下浸泡出有效成分的一種方法。
具體做法是: 取適量粉碎后的原料,置于加蓋容器中,加入適量的溶劑并密蓋,間斷式攪拌或震搖,浸漬至規(guī)定時間使有效成分浸出。取上清夜,過濾,壓榨殘渣,合并濾液和壓榨液, 過濾濃縮至適宜濃度, 可進一步制備流浸膏, 浸膏,片劑,沖劑等。
按提取溫度和浸漬的次數(shù)可分為冷浸潰法,熱浸潰法,重浸潰法。 滲漉法:滲漉法是將原料粗粉濕潤膨脹后裝入滲波器內(nèi),頂部用紗布覆蓋,壓緊,浸提溶劑連續(xù)地從滲漣器的上部加入, 溶劑滲過原料層往下流動過程中將與有效成分浸出的一種辦法。
不斷加入新溶劑, 可以連續(xù)收集浸提液, 由于原料不斷與新溶劑或含有低濃度提取物的溶劑接觸, 始終保持一定的濃度差, 浸提效果要比浸潰法高,提取比較完全,但溶劑用量大。滲滾法可分為單滲漉法,重滲漉法,加壓滲漉法,逆滲漉法。
煎煮法:煎煮法是指用水作溶劑,將被提物加熱煮沸一定時間,以提取其所含成分的一種常用方法, 又稱煮提法或煎浸法。 該法是將原料適當?shù)那兴榛蚍鬯槌纱址鄯湃脒m當容器中,加水浸過原料面,充分浸泡后,加熱煎煮2一3 次,每次l h左右。
直火加熱,要不斷攪拌以免焦糊。分離并收集各次煎出液,經(jīng)離心分離或沉濾過后,濃縮至所需濃度。
該法使用于有效成分能溶于水, 對濕,熱均穩(wěn)定且不易揮發(fā)的原料。 回流提取法: 回流提取法是用乙醇等易揮發(fā)的有機溶劑提取原料成分,將浸出液加熱蒸餾,其中揮發(fā)性溶劑餾出后又被冷卻,重復流回浸出容器中浸提原料, 這樣周而復始,直至有效成分回流提取完全的方法。
回流法提取液在蒸發(fā)鍋中受熱時間較長,故不使用于受熱易破壞的原料成分的浸出。 連續(xù)提取法:為了彌補回流提取法中需要溶劑量大,操作較繁的不足,可采用連續(xù)提取法。
當提取的有效成分在所選溶劑中不宜溶解時, 若采用回流提取需提十幾次, 既費時又過多耗費溶劑,在此情況下,可用連續(xù)回流提取法,用較少的溶劑一次提取便可提取完全。
蛋白質的分離純化方法:
一、根據(jù)蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析法:中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響,一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高,蛋白質的溶解度增加,此稱鹽溶;當鹽濃度繼續(xù)升高時,蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出,這種現(xiàn)象稱鹽析。
2、等電點沉淀法:蛋白質在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小,因而溶解度也最小,各種蛋白質的等電點有差別,可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀,但此法很少單獨使用,可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉淀法:用與水可混溶的有機溶劑,甲醇,乙醇或丙酮,可使多數(shù)蛋白質溶解度降低并析出,此法分辨力比鹽析高,但蛋白質較易變性,應在低溫下進行。
二、根據(jù)蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾:透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力,強使水和其他小的溶質分子通過半透膜,而蛋白質留在膜上,可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法: 也稱分子排阻層析或分子篩層析,這是根據(jù)分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠(Sephadex ged)和瓊脂糖凝膠(agarose gel)。
三、根據(jù)蛋白質帶電性質進行分離
1、電泳法:各種蛋白質在同一pH條件下,因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳,這是利用一種兩性電解質作為載體,電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的pH梯度,當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時,到達各自等電點的pH位置就停止,此法可用于分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法:離子交換劑有陽離子交換劑(如:羧甲基纖維素;CM-纖維素)和陰離子交換劑(二乙氨基乙基纖維素),當被分離的蛋白質溶液流經(jīng)離子交換層析柱時,帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上,隨后用改變pH或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
四、根據(jù)配體特異性的分離方法-親和色譜法
親和層析法(aflinity chromatography)是分離蛋白質的一種極為有效的方法,它經(jīng)常只需經(jīng)過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來,而且純度很高。這種方法是根據(jù)某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand)的分子能特異而非共價地結合。其基本原理:蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在,每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質,因此蛋白質的分離(Separation),提純(Purification)和鑒定(Characterization)是生物化學中的重要的一部分,至今還沒的單獨或一套現(xiàn)成的方法能移把任何一種蛋白質從復雜的混合蛋白質中提取出來,因此往往采取幾種方法聯(lián)合使用。
(一)溶劑提取法: 1.溶劑提取法的原理:溶劑提取法是根據(jù)中草藥中各種成分在溶劑中的溶解性質,選用對活性成分溶解度大,對不需要溶出成分溶解度小的溶劑,而將有效成分從藥材組織內(nèi)溶解出來的方法。
當溶劑加到中草藥原料(需適當粉碎)中時,溶劑由于擴散、滲透作用逐漸通過細胞壁透入到細胞內(nèi),溶解了可溶性物質,而造成細胞內(nèi)外的濃度差,于是細胞內(nèi)的濃溶液不斷向外擴散,溶劑又不斷進入藥材組織細胞中,如此多次往返,直至細胞內(nèi)外溶液濃度達到動態(tài)平衡時,將此飽和溶液濾出,繼續(xù)多次加入新溶劑,就可以把所需要的成分近于完全溶出或大部溶出。 中草藥成分在溶劑中的溶解度直接與溶劑性質有關。
溶劑可分為水、親本性有機溶劑及親脂性有機溶劑,被溶解物質也有親水性及親脂性的不同。 有機化合物分子結構中親水性基團多,其極性大而疏于油;有的親水性基團少,其。
極性小而疏于水。這種親水性、親脂性及其程度的大小,是和化合物的分子結構直接相關。
一般來說,兩種基本母核相同的成分,其分子中功能基的極性越大,或極性功能基數(shù)量越多,則整個分子的極性大,親水性強,而親脂性就越弱,其分子非極性部分越大,或碳鍵越長,則極性小,親脂性強,而親水性就越弱。 各類溶劑的性質,同樣也與其分子結構有關。
例如甲醇、乙醇是親水性比較強的溶劑,它們的分子比較小,有羥基存在,與水的結構很近似,所以能夠和水任意混合。丁醇和戊醇分子中雖都有羥基,保持和水有相似處,但分子逐漸地加大,與水性質也就逐漸疏遠。
所以它們能彼此部分互溶,在它們互溶達到飽和狀態(tài)之后,丁醇或戊醇都能與水分層。氯仿、苯和石油醚是烴類或氯烴衍生物,分子中沒有氧,屬于親脂性強的溶劑。
這樣,我們就可以通過時中草藥成分結構分析,去估計它們的此類性質和選用的溶劑。例如葡萄糖、蔗糖等分子比較小的多羥基化合物,具有強親水性,極易溶于水,就是在親水性比較強的乙醇中也難于溶解。
淀粉雖然羥基數(shù)目多,但分子大大,所以難溶解于水。蛋白質和氨基酸都是酸堿兩性化合物,有一定程度的極性,所以能溶于水,不溶于或難溶子有機溶劑。
甙類都比其甙元的親水性強,特別是皂甙由于它們的分子中往往結合有多數(shù)糖分子,羥基數(shù)目多,能表現(xiàn)出較強的親水性,而皂甙元則屬于親脂性強的化合物。多數(shù)游離的生物堿是親脂性化合物,與酸結合成鹽后,能夠離子化,加強了極性,就變?yōu)橛H水的注質,這些生物堿可稱為半極性化合物。
所以,生物堿的鹽類易溶于水,不溶或難溶于有機溶劑;而多數(shù)游離的生物堿不溶或難溶于水,易溶于親脂性溶劑,一般以在氯仿中溶解度最大。鞣質是多羥基的化臺物,為親水性的物質。
油脂、揮發(fā)油、蠟、脂溶性色素都是強親脂性的成分。 總的說來,只要中草藥成分的親水性和親脂性與溶劑的此項性質相當,就會在其中有較大的溶解度,即所謂“相似相溶”的規(guī)律。
這是選擇適當溶劑自中草藥中提取所需要成分的依據(jù)之一。 2.溶劑的選擇:運用溶劑提取法的關鍵,是選擇適當?shù)娜軇?/p>
溶劑選擇適當,就可以比較順利地將需要的成分提取出來。選擇溶劑要注意以下三點:①溶劑對有效成分溶解度大,對雜質溶解度?。虎谌軇┎荒芘c中藥的成分起化學變化;③溶劑要經(jīng)濟、易得、使用安全等。
3.提取方法:用溶劑提取中草藥成分,、常用浸漬法、滲漉法、煎煮法、回流提取法及連續(xù)回流提取法等。同時,原料的粉碎度、提取時間、提取溫度、設備條件等因素也都能影響提取效率,必須加以考慮。
1)浸漬法:浸漬法系將中草藥粉末或碎塊裝人適當?shù)娜萜髦?,加入適宜的溶劑(如乙醇、稀醇或水),浸漬藥材以溶出其中成分的方法。本法比較簡單易行,但浸出率較差,且如用水為溶劑,其提取液易于發(fā)霉變質)須注意加入適當?shù)姆栏瘎?/p>
2)滲漉法:滲漉法是將中草藥粉末裝在滲漉器中,不斷添加新溶劑,使其滲透過藥材,自上而下從滲漉器下部流出浸出液的一種浸出方法小當溶劑滲進藥粉溶出成分比重加大而向下移動時,上層的溶液或稀浸液便置換其位置,造成良好的濃度差,使擴散能較好地進行,故浸出效果優(yōu)于浸漬法。但應控制流速,在滲渡過程中隨時自藥面上補充新溶劑,使藥材中有效成分充分浸出為止。
或當滲滴液顏色極淺或滲涌液的體積相當于:原藥材重的10倍時,便可認為基本上已提取完全。在大量生產(chǎn)中常將收集的稀滲淮液作為另一批新原料的溶劑之用。
3)煎煮法:煎煮法是我國最早使用的傳統(tǒng)的浸出方法。所用容器一般為陶器、砂罐或銅制、搪瓷器皿,不宜用鐵鍋,以免藥液變色。
直火加熱時最好時常攪拌,以免局部藥材受熱太高,容易焦糊。有蒸汽加熱設備的藥廠,多采用大反應鍋、大銅鍋、大木桶,或水泥砌的池子中通入蒸汽加熱。
還可將數(shù)個煎煮器通過管道互相連接,進行連續(xù)煎浸。 4)回流提取法:應用有機溶劑加熱提取,需采用回流加熱裝置,以免溶劑揮發(fā)損失。
小量操作時,可在圓底燒瓶上連接回流冷凝器。瓶內(nèi)裝藥材約為容量的%~%,溶劑浸過藥材表面約1~2cm。
在水浴中加熱回流,一般保持沸騰約:小時小放冷過濾,再在藥渣中加溶劑,作。
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