細(xì)胞成分或結(jié)構(gòu)分離中的保護(hù)方法(細(xì)胞組分的分級分離時(shí)分離的方法有幾種)

1.細(xì)胞組分的分級分離時(shí)分離的方法有幾種

試想一下，若沒有各種方法來分離組成細(xì)胞的不同區(qū)室和組分，那么現(xiàn)代生物學(xué)將困難重重。

從細(xì)胞信號通路 到新陳代謝，人們一直想知道，它們在哪兒，過去、現(xiàn)在及將來。賽默飛世爾科技 的市場部經(jīng)理Monica O'Hara Noonan介紹，研究人員對細(xì)胞進(jìn)行分級分離（fractionate）的原因有很多。

他們可能希望，當(dāng)感興趣的蛋白在某些條件下或某種處理之后轉(zhuǎn)位時(shí)，對其進(jìn)行追蹤。對細(xì)胞進(jìn)行分級分離能增強(qiáng)低豐度蛋白的檢測能力，或降低下游分析或功能分析的復(fù)雜性。

如果您正在從事這一方面的研究，請繼續(xù)往下讀。從細(xì)胞 上講，我們會幫助您將小麥和谷殼分開。

細(xì)胞的組分 如何對細(xì)胞進(jìn)行分級分離取決于很多因素，包括哪些儀器 、知識可以利用，您想要分離什么，以及這些組分的下游應(yīng)用是什么。離心是細(xì)胞分級分離中最常用的技術(shù)之一，它們單獨(dú)使用，或與其他方法結(jié)合。

例如，對于高爾基體 或過氧化物酶體，大部分操作都要求高速的密度梯度離心。然而，O'Hara Noonan也指出，超速離心也有一些缺點(diǎn)，包括超速離心機(jī)是高價(jià)的儀器，有些實(shí)驗(yàn)室無法接觸到。

另外，密度梯度難以傾倒是出了名的，其結(jié)果是技術(shù)依賴的。當(dāng)然，其他的許多組分也可以只利用試劑和臺式儀器來富集。

供應(yīng)商開發(fā)出一些試劑盒，能方便快捷地帶來高度富集的細(xì)胞組分。賽默飛世爾 全新設(shè)計(jì)的Mem-PER Plus試劑盒，能在一小時(shí)之內(nèi)富集完整的膜相關(guān)蛋白。

據(jù)sigma-aldrich 的產(chǎn)品專家Michael Moehlenbrock介紹，這類試劑盒的原理在很大程度上是類似的。它們往往使用低滲緩沖液給細(xì)胞膜帶來壓力，然后用等滲的提取緩沖液（帶或不帶還原劑和蛋白酶抑制劑）來維持感興趣的細(xì)胞器。

有時(shí)也需要機(jī)械裂解或去污劑裂解。“各個(gè)不同供應(yīng)商在細(xì)胞分級分離試劑盒的設(shè)計(jì)上都是一致的，而不同細(xì)胞組分的差異在于緩沖液組成、裂解試劑和離心速度，”Moehlenbrock說。

此類試劑盒的價(jià)值并不在于某些秘密試劑，而在于QC系統(tǒng)的一致性和重復(fù)性?！凹?xì)胞分級分離的方法已經(jīng)過充分鑒定，其操作步驟適用于大部分應(yīng)用，”Moehlenbrock說。

“商業(yè)化試劑盒為最終用戶帶來了簡便和效率，同時(shí)提供了品質(zhì)保證的安全性?！?通過改變穿插在離心步驟之間的緩沖液的去污劑組分，研究人員可分離不止一個(gè)組分。

例如，市場上許多試劑盒可收集細(xì)胞核和胞漿蛋白。其他試劑盒也帶來了三個(gè)或四個(gè)不同的組分。

Cell Signaling Technology的Cell Fractionation Kit產(chǎn)生了細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜/細(xì)胞器以及細(xì)胞核/細(xì)胞骨架組分，而QIAGEN的Qproteome Cell Compartment Kit分離出細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和細(xì)胞骨架組分。美天旎提供一種不含去污劑的試劑盒，它利用TOM22抗體標(biāo)記的磁珠來特異分離線粒體。

據(jù)該公司的技術(shù)支持介紹，他們不提供其他亞細(xì)胞組分的產(chǎn)品，但客戶可以利用自己的抗體來間接分離其他組分。同樣地，賽默飛世爾的Cell Surface Protein Isolation Kit標(biāo)記細(xì)胞表面蛋白的外部賴氨酸，它具有一個(gè)可切割的生物素衍生物，讓此蛋白組分在細(xì)胞裂解后可被捕獲。

其中有什么 在細(xì)胞組分被分離出來之后，必須驗(yàn)證您的實(shí)驗(yàn)，并確認(rèn)這些組分確實(shí)包含了您要分離的。盡管這些試劑盒通常不包含區(qū)分各種組分的試劑，但許多會指出不同的看家基因，讓您用來確保質(zhì)量。

Moehlenbrock表示：“在某些情況下，我們會提供分析的建議?！崩纾琒igma-Aldrich Mitochondria Isolation Kit的技術(shù)指南建議檢查細(xì)胞色素c氧化酶活性和檸檬酸合酶活性，以確認(rèn)外膜和內(nèi)膜的完整性。

Cell Signaling Technology也提供Cell Fractionation Antibody Sampler Kit，作為分級分離試劑盒的伴隨產(chǎn)品。生產(chǎn)科學(xué)家Jim Cormier介紹，當(dāng)您在運(yùn)行Western時(shí)，您會得到一個(gè)量化值，哪些組分占多少。

Sampler Kit包含細(xì)胞質(zhì)MEK1/2、線粒體凋亡誘導(dǎo)因子（AIF）、組蛋白H3和細(xì)胞骨架波形蛋白的兔單克隆抗體，以及山羊抗兔IgG。研究人員也可利用試劑盒中的建議，或搜索文獻(xiàn)，組裝自己的Western blot或ELISA試劑盒。

不過Cormier也提醒，并非每個(gè)抗體都有著它應(yīng)有的特異性。下游的分析 與超速離心相比，基于試劑盒的細(xì)胞分級分離方法快速又方便，也適合多個(gè)下游應(yīng)用，如EMSA、報(bào)告基因分析、酶活分析和Western blot。

然而，制備過程中所使用的去污劑和鹽可能阻礙蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，如質(zhì)譜，“這有時(shí)取決于去污劑的量，去除的容易程度，以及是否用于功能分析，”O(jiān)'Hara Noonan說?！霸谀承┣闆r下，您可能需要透析或脫鹽?！?/p>

同樣地，有時(shí)可能需要額外的步驟，來增加產(chǎn)物的純度。在讀研究生時(shí)，Moehlenbrock一般使用臺式離心機(jī)來制備線粒體。

“有時(shí)我會用11,000 x g來去除細(xì)胞碎片。之后獲得線粒體提取物，并用蔗糖梯度和超速離心機(jī)來進(jìn)一步純化。

這取決于您想做什么，。

2.簡述主要免疫細(xì)胞分離方法和分離原理

免疫磁珠法分離細(xì)胞原理：免疫磁珠法分離細(xì)胞是基于細(xì)胞表面抗原能與連接有磁珠的特異性單抗相結(jié)合，在外加磁場中，通過抗體與磁珠相連的細(xì)胞被吸附而滯留在磁場中，無該種表面抗原的細(xì)胞由于不能與連接著磁珠的特異性單抗結(jié)合而沒有磁性，不在磁場中停留，從而使細(xì)胞得以分離。

免疫磁珠法分為陽性分離法和陰性分離法：陽性分離法-磁珠結(jié)合的細(xì)胞就是所要分離獲得的細(xì)胞 陰性分離法-磁珠結(jié)合不需要的細(xì)胞，游離于磁場的細(xì)胞為所需細(xì)胞 一般而言，陰性分離法的磁珠用量比陽性分離法的大，陽性分離法用行更多。BD? Imag 磁珠：· 大小在0.1-0.45mm · 包被了BD Pharmingen生產(chǎn)的高質(zhì)量單抗 · 磁珠已為白細(xì)胞亞群的陽性和陰性分離法所優(yōu)化 · 用于BD? IMagnet direct magnet 將包被了特異性單抗的BD IMag磁珠加入細(xì)胞懸液，磁珠特異性地與有相應(yīng)抗原的細(xì)胞亞群結(jié)合，通過BD? IMagnet direct magnet分離得到的連有BD IMag磁珠的細(xì)胞可直接用于功能試驗(yàn)和用流式細(xì)胞儀檢測。

缺點(diǎn)：? 對細(xì)胞造成機(jī)械壓力，影響其生物學(xué)活性，不利于分離后培養(yǎng) ? 純度低 ? 容易阻塞FCM的噴嘴 BD IMag吸收大磁珠和小磁珠分離系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)，開發(fā)出直徑約200nm中等大小磁珠。? 技術(shù)簡單，分離在普通的試管中完成 ? 易于增大細(xì)胞用量 ? 對細(xì)胞溫和，不影響細(xì)胞功能及其分離后培養(yǎng)，可直接上流式 ? 純度高，回收率高 ? 成本低 此外，Mouse lineage panel中biotin標(biāo)記的抗體還可用于FCM分析細(xì)胞表面抗原，以及進(jìn)行細(xì)胞/組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)。

BD提供2種免疫磁珠：· 包被了針對白細(xì)胞亞群的單抗的磁珠 · 包被了鏈霉親和素（streptavidin）的磁珠：此種情況下，在實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中加入生物素標(biāo)記的單抗，磁珠通過streptavidin與生物素標(biāo)記的單抗結(jié)合，單抗與細(xì)胞表面相應(yīng)抗原特異性結(jié)合而使細(xì)胞被磁珠間接捕獲，從而達(dá)到分離。這種磁珠使研究者可根據(jù)自己需要選擇生物素標(biāo)記的各種單抗去分離目的細(xì)胞，應(yīng)用范圍更廣泛，使用更靈活。

不同物種磁珠分離試劑 人： CD3, CD4, CD8, CD14, CD19；小鼠： CD4, CD8a, CD14, CD45R/B220, CD90.2 (Thy1.2), CD11b, Ly-6G.? 利用Streptavidin連接的磁珠，只需選配biotin標(biāo)記的所需單抗，就能分離更多種類細(xì)胞 新貨聚焦：現(xiàn)在，BD PMG又推出用于分離小鼠造血干細(xì)胞/祖細(xì)胞的新試劑mouse lineage panel。其中包括5種biotin標(biāo)記單抗，這些單抗能結(jié)合小鼠造血細(xì)胞的主要分化系細(xì)胞： T、B淋巴細(xì)胞，單核/巨噬細(xì)胞，粒細(xì)胞和紅細(xì)胞。

將這組試劑與Streptavidin Plus BD? IMag Particles (557812) 聯(lián)合使用，就能通過免疫磁性分離法去除小鼠骨髓造血細(xì)胞的主要分化系細(xì)胞，從而富集到造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（陰性片斷）。Mouse Lineage Panel(559971):(5*2ml/vial) 可分離109 Mouse骨髓細(xì)胞1) Biotin-anti-mouse CD3e (CD3 e chain);2) Biotin-anti-mouse CD11b;3) Biotin-anti-mouse CD45R/B220;4) Biotin-anti-mouse Ly-6G and Ly-6C (Gr-1);5) Biotin-anti-mouse TER-119/Erythroid Cells (Ly-76) 磁分離細(xì)胞的重要指標(biāo)是：純度和得率，這取決于磁珠所連接單抗的特異性和磁珠大?。ù判裕?，然而太大的磁珠會影響細(xì)胞活性，也無法直接上流式。

目前市場上有2種磁性細(xì)胞分離系統(tǒng)：* Small particles （≈50 nm） - MACS* Large particles (1200~4500 nm) -others（如Dynal） 小磁珠 優(yōu)點(diǎn)：? 對細(xì)胞溫和，不影響分離細(xì)胞的后續(xù)培養(yǎng) ? 可直接上流式檢測，不影響散射光 缺點(diǎn)：? 需要很強(qiáng)的磁場來分離細(xì)胞 ? 分離速度很慢，得率不高 ? 需要一次性的分離柱，不能在普通試管進(jìn)行 ? 成本昂貴 大磁珠 ? 技術(shù)簡單，分離可在試管中完成 ? 易于增減細(xì)胞用量 ? 速度快，得率高 ? 成本低。