測(cè)定微生物的生物量有哪些主要方法
?測(cè)定的方法主要有四種:
1.直接計(jì)數(shù)測(cè)定:根據(jù)微生物種類(lèi),有血球計(jì)數(shù)板和細(xì)菌計(jì)數(shù)板;
2.比濁法:根據(jù)菌懸液的濃度在一定范圍內(nèi)與光密度成正比,可以用分光光度計(jì)測(cè)OD值,用OD值表示樣品菌液濃度;
3.核酸計(jì)數(shù)法:熒光定量PCR技術(shù);
4.活菌計(jì)數(shù)法:MPN和平板計(jì)數(shù)法由于測(cè)定方法的限制。新鮮土樣經(jīng)氯仿熏蒸后(24h),土壤微生物死亡細(xì)胞發(fā)生裂解,釋放出微生物生物量碳,用一定體積的LK2SO4溶液提取土壤,借用有機(jī)碳自動(dòng)分析儀測(cè)定微生物生物量碳含量。根據(jù)熏蒸土壤與未熏蒸土壤測(cè)定有機(jī)碳的差值及轉(zhuǎn)換系數(shù)(KEC),從而計(jì)算土壤微生物生物量碳。
常用測(cè)定微生物生長(zhǎng)的方法有:
1)稱(chēng)干重法.可用離心法或過(guò)濾法測(cè)定.優(yōu)點(diǎn):可適用于一切微生物,缺點(diǎn):無(wú)法區(qū)別死菌和活菌.
2)比濁法.原理:由于微生物在液體培養(yǎng)時(shí),原生質(zhì)的增加導(dǎo)致混濁度的增加,可用分光光度計(jì)測(cè)定.優(yōu)點(diǎn):比較準(zhǔn)確.
3)測(cè)含氮量,大多數(shù)微生物的含氮量占干重的比例較一致,根據(jù)含氮量再乘以6.25即可測(cè)得其粗蛋白的含量.
4)血球計(jì)數(shù)板法.優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速、直觀(guān).缺點(diǎn):結(jié)果包括死菌和活菌.
5)液體稀釋法.對(duì)未知菌樣作連續(xù)的10倍系列稀釋?zhuān)?jīng)培養(yǎng)后,記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù),然后查MPN表,再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可計(jì)算其中的活菌含量.優(yōu)點(diǎn):可計(jì)算活菌數(shù),較準(zhǔn)確.缺點(diǎn):比較繁瑣.
6)平板菌落計(jì)數(shù)法.取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養(yǎng)基,經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)算原菌液的含菌數(shù).優(yōu)點(diǎn),可以獲得活菌的信息.缺點(diǎn):操作繁瑣,需要培養(yǎng)一定時(shí)間才能獲得,測(cè)定結(jié)果受多種因素的影響.
細(xì)菌計(jì)數(shù)1.計(jì)數(shù)器測(cè)定法:
即用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室內(nèi),用顯微鏡觀(guān)察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的(O.1mm3),因而根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù),可計(jì)算樣品中的含菌數(shù)。本法簡(jiǎn)便易行,可立即得出結(jié)果。
本法不僅適于細(xì)菌計(jì)數(shù),也適用于酵母菌及霉菌孢子計(jì)數(shù)。
2、電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法:
電子計(jì)數(shù)器的工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化,小孔僅能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞,當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過(guò)這個(gè)小孔時(shí),電阻明顯增加,形成一個(gè)脈沖,自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。
該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確,但它只識(shí)別顆粒大小,而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此,要求菌懸液中不含任何碎片。
3、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法
常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法,是根據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液,作一系列的倍比稀釋?zhuān)缓髮⒍康南♂屢哼M(jìn)行平板培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù),可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高,是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法,也是目前國(guó)際上許多國(guó)家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意:①一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),過(guò)多或過(guò)少均不準(zhǔn)確;②為了防止菌落蔓延,影響計(jì)數(shù),可在培養(yǎng)基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細(xì)菌檢驗(yàn),是最常用的活菌計(jì)數(shù)法。
4、比濁法
比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比,與光密度成正比,所以,可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液,用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。
此法簡(jiǎn)便快捷,但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液,得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目,對(duì)顏色太深的樣品,不能用此法測(cè)定。
5、測(cè)定細(xì)胞重量法
此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱(chēng)重;干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后,以清水洗凈放人干燥器加熱烘干,使之失去水分然后稱(chēng)重。
此法適于菌體濃度較高的樣品,是測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量的一種常用方法。
6、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量
氮、碳是細(xì)胞的主要成分,含量較穩(wěn)定,測(cè)定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。
7、顏色改變單位法(colour change unit,簡(jiǎn)稱(chēng)CCU)
這種方法通常用于很小,用一般的比濁法無(wú)法計(jì)數(shù)的微生物,比如支原體等,因?yàn)橹гw的液體培養(yǎng)物是完全透明的,呈現(xiàn)為清亮透明紅色,因此無(wú)法用比濁法來(lái)計(jì)數(shù),由于支原體固體培養(yǎng)很困難,用cfu法也不容易計(jì)數(shù),因此需要用特殊的計(jì)數(shù)方法,即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo),來(lái)計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的,下面以解脲脲原體為例單介紹其操作:,簡(jiǎn)
(1)取12只無(wú)菌試管,每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。
(2)在第一管加入0.2ml待測(cè)解脲脲原體菌液,充分混勻,從中吸取0.2ml加入第二管,依次類(lèi)推,10倍梯度稀釋?zhuān)恢钡阶钅┮还?/p>
(3)于37度培養(yǎng),以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測(cè)菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力,比如第六管出現(xiàn)顏色改變,他的相對(duì)濃度就是10的6次方CCU/ml.
一般來(lái)說(shuō),比濁法和菌落計(jì)數(shù)法就可以滿(mǎn)足絕大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù),但是對(duì)支原體這樣比較特殊的微生物,用CCU法比較合適。
1.實(shí)驗(yàn)方法 實(shí)驗(yàn)方法是整個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的精髓,是做好實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的關(guān)鍵所在.現(xiàn)將與中學(xué)實(shí)驗(yàn)有關(guān)的一些最常見(jiàn)的經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)方法匯總?cè)缦拢海?)化學(xué)物質(zhì)的檢測(cè)方法:①淀粉——碘液 ②還原糖——斐林試劑、班氏試劑 ③CO2——Ca(OH)2溶液或酸堿指示劑 ④乳酸——pH試紙 ⑤O2——余燼復(fù)燃 ⑥無(wú)O2——火焰熄滅 ⑦蛋白質(zhì)——雙縮脲試劑 ⑧染色體——龍膽紫、醋酸洋紅溶液 ⑨DNA——二苯胺試劑 ⑩脂肪——蘇丹Ⅲ或蘇丹Ⅳ染液(2)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的顯示方法:①光合速率——O2釋放量或CO2吸收量或淀粉產(chǎn)生量 ②呼吸速率——O2吸收量或CO2釋放量或淀粉減少量 ③原子途徑——放射性同位素示蹤法 ④細(xì)胞液濃度大小——質(zhì)壁分離 ⑤細(xì)胞是否死亡——質(zhì)壁分離 ⑥甲狀腺激素作用——?jiǎng)游锖难趿浚l(fā)育速度等 ⑦生長(zhǎng)激素作用——生長(zhǎng)速度(體重變化,身高變化) ⑧胰島素作用——?jiǎng)游锘顒?dòng)狀態(tài) ⑨菌量——菌落數(shù)或亞甲基藍(lán)溶液褪色程度 ⑩大腸桿菌——伊紅—美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基(3)實(shí)驗(yàn)條件的控制方法:①增加水中氧氣——泵入空氣或吹氣或放入綠色植物 ②減少水中氧氣——容器密封或油膜覆蓋或用涼開(kāi)水 ③除去容器中CO2——NaOH溶液 ④除去葉片中原有淀粉——置于黑暗環(huán)境 ⑤除去葉片中葉綠素——酒精隔水加熱 ⑥除去光合作用對(duì)呼吸作用的干擾——給植株遮光 ⑦如何得到單色光——棱鏡色散或彩色薄膜濾光 ⑧血液抗凝——加入檸檬酸鈉 ⑨線(xiàn)粒體提取——細(xì)胞勻漿離心 ⑩骨的脫鈣——鹽酸溶液 ⑾滅菌方法——微生物培養(yǎng)的關(guān)鍵在于滅菌,對(duì)不同材料,滅菌方法不同:培養(yǎng)基用高壓蒸氣滅菌;接種環(huán)用火焰灼燒滅菌;雙手用肥皂洗凈,擦干后用75%酒精消毒;整個(gè)接種過(guò)程都在實(shí)驗(yàn)室無(wú)菌區(qū)進(jìn)行.(4)實(shí)驗(yàn)中控制溫度的方法:①還原糖鑒定:水浴煮沸加熱 ②酶促反應(yīng):水浴保溫 ③用酒精溶解葉中的葉綠素:酒精要隔水加熱 ④DNA的鑒定:水浴煮沸加熱 ⑤細(xì)胞和組織培養(yǎng)以及微生物培養(yǎng):恒溫培養(yǎng)2.斐林試劑、班氏試劑與尿糖試紙 這三種物質(zhì)均可用來(lái)檢驗(yàn)含醛基的有機(jī)物的存在,在醫(yī)學(xué)上用來(lái)檢驗(yàn)糖尿病,其原理均是利用了Cu2+的氧化性把醛基氧化,但成分略有不同:斐林試劑:即硫酸銅、氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉組成的藍(lán)色混合溶液.分為斐林試劑A和斐林試劑B,A為CuSO4溶液,B為氫氧化鈉和酒石酸鉀鈉的混合溶液,使用時(shí)將A、B等體積混合即成斐林試劑.班氏試劑:即硫酸銅、碳酸鈉和檸檬酸鈉組成的混合液,又叫本尼迪克特(Benedict)試劑,它與醛反應(yīng)的結(jié)果是與斐林試劑一致的,只是比斐林試劑更穩(wěn)定,所以在臨床化驗(yàn)中更常使用.尿糖試紙:又叫硫酸銅試紙,呈白色,帶藍(lán)色斑點(diǎn),用于糖尿病患者的尿糖測(cè)試.每片含硫酸銅20毫克,枸櫞酸300毫克,碳酸鈉80毫克,氫氧化鈉235毫克.尿糖試紙法快速、方便,試紙的正確使用方法為:將試紙條放在尿液中浸濕,一秒鐘后取出,在一分鐘內(nèi)觀(guān)察試紙的顏色,并與標(biāo)準(zhǔn)色板對(duì)照,根據(jù)不同的顏色來(lái)確定尿糖陽(yáng)性的程度.3.斐林試劑和雙縮脲試劑的比較 相同點(diǎn):①都由NaOH溶液和CuSO4溶液構(gòu)成;②斐林試劑甲液和雙縮脲試劑A都為0.1g/mLNaOH溶液.不同點(diǎn):①CuSO4溶液濃度不一樣:斐林試劑乙液為0.05g/mLCuSO4溶液,雙縮脲試劑B為0.01g/mLCuSO4溶液.②配制比例不一樣.③使用方法不一樣:斐林試劑是甲、乙液一起混合后再使用,雙縮脲試劑則是先向待鑒定材料加入A試劑搖勻后,再加入試劑B.④鑒定的對(duì)象不一樣:斐林試劑鑒定的是還原糖,雙縮脲試劑鑒定的是蛋白質(zhì).⑤反應(yīng)本質(zhì)及顏色反應(yīng)不一樣.4.蘇丹Ⅲ染液與蘇丹Ⅳ染液的比較 都是用來(lái)鑒定脂肪.蘇丹Ⅳ染液更易溶于脂肪,所以染色更深,同時(shí)要求染色時(shí)間更短.生物學(xué)中常用的試劑:1、斐林試劑: 成分:0.1g/ml NaOH(甲液)和0.05g/ml CuSO4(乙液).用法:將斐林試劑甲液和乙液等體積混合,再將混合后的斐林試劑倒入待測(cè)液,水浴加熱或直接加熱,如待測(cè)液中存在還原糖,則呈磚紅色.2、班氏糖定性試劑:為藍(lán)色溶液.和葡萄糖混合后沸水浴會(huì)出現(xiàn)磚紅色沉淀.用于尿糖的測(cè)定.3、雙縮脲試劑:成分:0.1g/ml NaOH(甲液)和0.01g/ml CuSO4(乙液).用法:向待測(cè)液中先加入2ml甲液,搖勻,再向其中加入3~4滴乙液,搖勻.如待測(cè)中存在蛋白質(zhì),則呈現(xiàn)紫色.4、蘇丹Ⅲ:用法:取蘇丹Ⅲ顆粒溶于95%的酒精中,搖勻.用于檢測(cè)脂肪.可將脂肪染成橘黃色(被蘇丹Ⅳ染成紅色).5、二苯胺:用于鑒定DNA.DNA遇二苯胺(沸水浴)會(huì)被染成藍(lán)色.6、甲基綠:用于鑒定DNA.DNA遇甲基綠(常溫)會(huì)被染成藍(lán)綠色.(甲基綠使DNA呈現(xiàn)綠色,吡羅紅使RNA呈現(xiàn)紅色.)7、50%的酒精溶液:在脂肪鑒定中,用蘇丹Ⅲ染液染色,再用50%的酒精溶液洗去浮色.8、75%的酒精溶液:用于殺菌消毒,75%的酒精能滲入細(xì)胞內(nèi),使蛋白質(zhì)凝固變性.低于這個(gè)濃度,酒精的滲透脫水作用減弱,殺菌力不強(qiáng);而高于這個(gè)濃度,則會(huì)使細(xì)菌表面蛋白質(zhì)迅速脫水,凝固成膜,妨礙酒精透入,削弱殺菌能力.75%的酒精溶液常用于手術(shù)前、打針、換藥、針灸前皮膚脫碘消毒以及機(jī)械消毒等.9、95%的酒精溶液:冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精可用于凝集DNA.10、。
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細(xì)菌計(jì)數(shù)1.計(jì)數(shù)器測(cè)定法:
即用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器進(jìn)行計(jì)數(shù)。取一定體積的樣品細(xì)胞懸液置于血細(xì)胞計(jì)數(shù)器的計(jì)數(shù)室內(nèi),用顯微鏡觀(guān)察計(jì)數(shù)。由于計(jì)數(shù)室的容積是一定的(O.1mm3),因而根據(jù)計(jì)數(shù)器刻度內(nèi)的細(xì)菌數(shù),可計(jì)算樣品中的含菌數(shù)。本法簡(jiǎn)便易行,可立即得出結(jié)果。
本法不僅適于細(xì)菌計(jì)數(shù),也適用于酵母菌及霉菌孢子計(jì)數(shù)。
2、電子計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)法:
電子計(jì)數(shù)器的工作原理是測(cè)定小孔中液體的電阻變化,小孔僅能通過(guò)一個(gè)細(xì)胞,當(dāng)一個(gè)細(xì)胞通過(guò)這個(gè)小孔時(shí),電阻明顯增加,形成一個(gè)脈沖,自動(dòng)記錄在電子記錄裝置上。
該法測(cè)定結(jié)果較準(zhǔn)確,但它只識(shí)別顆粒大小,而不能區(qū)分是否為細(xì)菌。因此,要求菌懸液中不含任何碎片。
3、活細(xì)胞計(jì)數(shù)法
常用的有平板菌落計(jì)數(shù)法,是根據(jù)每個(gè)活的細(xì)菌能長(zhǎng)出一個(gè)菌落的原理設(shè)計(jì)的。取一定容量的菌懸液,作一系列的倍比稀釋?zhuān)缓髮⒍康南♂屢哼M(jìn)行平板培養(yǎng),根據(jù)培養(yǎng)出的菌落數(shù),可算出培養(yǎng)物中的活菌數(shù)。此法靈敏度高,是一種檢測(cè)污染活菌數(shù)的方法,也是目前國(guó)際上許多國(guó)家所采用的方法。使用該法應(yīng)注意:①一般選取菌落數(shù)在30~300之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù),過(guò)多或過(guò)少均不準(zhǔn)確;②為了防止菌落蔓延,影響計(jì)數(shù),可在培養(yǎng)基中加入O.001%2,3,5一氯化三苯基四氮唑(TTC);③本法限用于形成菌落的微生物。
廣泛應(yīng)用于水、牛奶、食物、藥品等各種材料的細(xì)菌檢驗(yàn),是最常用的活菌計(jì)數(shù)法。
4、比濁法
比濁法是根據(jù)菌懸液的透光量間接地測(cè)定細(xì)菌的數(shù)量。細(xì)菌懸浮液的濃度在一定范圍內(nèi)與透光度成反比,與光密度成正比,所以,可用光電比色計(jì)測(cè)定菌液,用光密度(OD值)表示樣品菌液濃度。
此法簡(jiǎn)便快捷,但只能檢測(cè)含有大量細(xì)菌的懸浮液,得出相對(duì)的細(xì)菌數(shù)目,對(duì)顏色太深的樣品,不能用此法測(cè)定。
5、測(cè)定細(xì)胞重量法
此法分為濕重法和干重法。濕重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后將濕菌體進(jìn)行稱(chēng)重;干重法系單位體積培養(yǎng)物經(jīng)離心后,以清水洗凈放人干燥器加熱烘干,使之失去水分然后稱(chēng)重。
此法適于菌體濃度較高的樣品,是測(cè)定絲狀真菌生長(zhǎng)量的一種常用方法。
6、測(cè)定細(xì)胞總氮量或總碳量
氮、碳是細(xì)胞的主要成分,含量較穩(wěn)定,測(cè)定氮、碳的含量可以推知細(xì)胞的質(zhì)量。此法適于細(xì)胞濃度較高的樣品。
7、顏色改變單位法(colour change unit,簡(jiǎn)稱(chēng)CCU)
這種方法通常用于很小,用一般的比濁法無(wú)法計(jì)數(shù)的微生物,比如支原體等,因?yàn)橹гw的液體培養(yǎng)物是完全透明的,呈現(xiàn)為清亮透明紅色,因此無(wú)法用比濁法來(lái)計(jì)數(shù),由于支原體固體培養(yǎng)很困難,用cfu法也不容易計(jì)數(shù),因此需要用特殊的計(jì)數(shù)方法,即CCU法。它是以微生物在培養(yǎng)基中的代謝活力為指標(biāo),來(lái)計(jì)數(shù)微生物的相對(duì)含量的,下面以解脲脲原體為例單介紹其操作:,簡(jiǎn)
(1)取12只無(wú)菌試管,每一管裝1.8ml解脲脲原體培養(yǎng)基。
(2)在第一管加入0.2ml待測(cè)解脲脲原體菌液,充分混勻,從中吸取0.2ml加入第二管,依次類(lèi)推,10倍梯度稀釋?zhuān)恢钡阶钅┮还?/p>
(3)于37度培養(yǎng),以培養(yǎng)基顏色改變的最末一管作為待測(cè)菌液的CCU,也就是支原體的最大代謝活力,比如第六管出現(xiàn)顏色改變,他的相對(duì)濃度就是10的6次方CCU/ml.
一般來(lái)說(shuō),比濁法和菌落計(jì)數(shù)法就可以滿(mǎn)足絕大多數(shù)細(xì)菌的計(jì)數(shù),但是對(duì)支原體這樣比較特殊的微生物,用CCU法比較合適。
v常用測(cè)定微生物生長(zhǎng)的方法有:1)稱(chēng)干重法。
可用離心法或過(guò)濾法測(cè)定。優(yōu)點(diǎn):可適用于一切微生物,缺點(diǎn):無(wú)法區(qū)別死菌和活菌。
2)比濁法。原理:由于微生物在液體培養(yǎng)時(shí),原生質(zhì)的增加導(dǎo)致混濁度的增加,可用分光光度計(jì)測(cè)定。
優(yōu)點(diǎn):比較準(zhǔn)確。3)測(cè)含氮量,大多數(shù)微生物的含氮量占干重的比例較一致,根據(jù)含氮量再乘以6.25即可測(cè)得其粗蛋白的含量。
4)血球計(jì)數(shù)板法。優(yōu)點(diǎn):簡(jiǎn)便、快速、直觀(guān)。
缺點(diǎn):結(jié)果包括死菌和活菌。5)液體稀釋法。
對(duì)未知菌樣作連續(xù)的10倍系列稀釋?zhuān)?jīng)培養(yǎng)后,記錄每個(gè)稀釋度出現(xiàn)生長(zhǎng)的試管數(shù),然后查MPN表,再根據(jù)樣品的稀釋倍數(shù)就可計(jì)算其中的活菌含量。優(yōu)點(diǎn):可計(jì)算活菌數(shù),較準(zhǔn)確。
缺點(diǎn):比較繁瑣。6)平板菌落計(jì)數(shù)法。
取一定體積的稀釋菌液涂布在合適的固體培養(yǎng)基,經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)算原菌液的含菌數(shù)。優(yōu)點(diǎn),可以獲得活菌的信息。
缺點(diǎn):操作繁瑣,需要培養(yǎng)一定時(shí)間才能獲得,測(cè)定結(jié)果受多種因素的影響。
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