確定酶的純化方法(酶的分離和純化方法是什么)

1.酶的分離和純化方法是什么

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。

首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。

酶分離純化的最終目的是獲得單一純凈的酶，因此，容許在不破壞“目的酶”的限度內(nèi)，使用各種手段；酶與底物和抑制劑的結(jié)合常使其理化性質(zhì)和穩(wěn)定性發(fā)生改變，這種特性已被用于酶的分離純化。

由于酶及其來源的多樣性及與之共存的高分子物質(zhì)的復(fù)雜性，目前還很難找到一種通用的方法以適用于一切酶的純化。為了使一種酶達(dá)到高度純化，往往需要多種方法協(xié)同作用，通過酶活性的跟蹤檢測確定最佳流程。

擴(kuò)展資料：

酶的本性是蛋白質(zhì)，凡可用于蛋白質(zhì)分離純化的方法都同樣適用于酶，但酶易失活，故分離純化需在低溫（4℃）、溫和pH(4<pH>10)等條件下進(jìn)行。

與蛋白質(zhì)類似，酶易在溶液表面或界面處形成薄膜而變性，因此操作中應(yīng)盡量減少泡沫形成，此外重金屬易使酶失效，有機(jī)溶劑能使酶變性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在能使酶分解破壞。

在進(jìn)行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物。得到純培養(yǎng)的過程稱是分離純化。

參考資料來源：百度百科——酶分離純化方法

2.酶的純化有哪些方法

酶是蛋白質(zhì)，因此凡用于蛋白質(zhì)的純化手段均適用于酶的純化，如鹽析法、聚乙二醇沉淀法、有機(jī)浴劑分級沉淀法、等電點法、選擇性沉淀法、各種柱層析法（吸附層析、離子交換層析、凝膠過濾）、各種電泳法及親和層析等。

不同之處是酶的純化過程尚需選用迅速簡便的活力測定方法，以追蹤酶的去向。在選用酶的活力測定方法時，分析方法的迅速要比其精確度更為重要。

如寧可要一個需時5min，準(zhǔn)確度為5%的方法；也不要一個需時30 min，準(zhǔn)確度為0.5%的方法。在建立活力測定法之后，再根據(jù)各單元純化步驟及活力分布情況用列表形式表達(dá)，表的內(nèi)容包括：操作步驟、總體積、酶濃度（每毫升酶活力）、總活力、蛋白質(zhì)濃度mg/ml）、比活力（即純度、酶活力單位/毫克蛋白）、產(chǎn)率%（每步總活力除以第一步的總活力）和純化倍數(shù)（每步比活力除以第一步比活力）。

3.酶進(jìn)行提純的方法是什么

酶，從動植物細(xì)胞和微生物中提取之后，往往不能直接應(yīng)用，這是因為生物在合成酶的同時也合成其他大分子物質(zhì)。而這些大分子物質(zhì)會嚴(yán)重干擾酶的作用，因此必須把酶從中分離出來。如果酶不純，那么極有可能在應(yīng)用中形成幾個生化反應(yīng)同時進(jìn)行，結(jié)果得到的產(chǎn)物也就不是單一的。當(dāng)然，酶并不是越純越好。不同的生物化學(xué)反應(yīng)，對酶的純度要求也不一樣。因此，要把酶制成不同的酶制劑，以便適應(yīng)各種需求。

要對酶進(jìn)行分離和提純，有多種方法。當(dāng)酶從生物細(xì)胞以及微生物中產(chǎn)生之后，可能留在細(xì)胞內(nèi)，也可能分泌到細(xì)胞外面。如果是胞外酶，這就方便多了，只要收集微生物和細(xì)胞的培養(yǎng)液進(jìn)行分離和提純就可以了。如果酶在細(xì)胞內(nèi)（稱胞內(nèi)酶），則必須研碎細(xì)胞，才能把酶提取出來。不論是胞外酶還是胞內(nèi)酶，都可能會含有一些其他大分子物質(zhì)，如核酸、蛋白質(zhì)和淀粉之類的東西。

對付核酸，只要在酶溶液中加入核酸酶，就可以去掉核酸。對于淀粉也比較好辦。最難對付的是蛋白質(zhì)，因為酶也是蛋白質(zhì)，能破壞蛋白質(zhì)的方法也可以破壞酶，所以提純是件比較困難的事。但隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步，經(jīng)過研究，已找到沉淀法、分子過濾法等。采用以上提純方法，就可以得到不同純度的酶，這為酶的廣泛應(yīng)用打開了方便之門。

4.提取酶的方法有哪些

酶是蛋白質(zhì)，可以根據(jù)其特點選擇適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)提取純化方法！選擇材料及預(yù)處理 以蛋白質(zhì)和結(jié)構(gòu)與功能為基礎(chǔ)，從分子水平上認(rèn)識生命現(xiàn)象，已經(jīng)成為現(xiàn)代生物學(xué)發(fā)展的主要方向，研究蛋白質(zhì)，首先要得到高度純化并具有生物活性的目的物質(zhì)。

蛋白質(zhì)的制備工作涉及物理、化學(xué)和生物等各方面知識，但基本原理不外乎兩方面。一是得用混合物中幾個組分分配率的差別，把它們分配到可用機(jī)械方法分離的兩個或幾個物相中，如鹽析，有機(jī)溶劑提取，層析和結(jié)晶等；二是將混合物置于單一物相中，通過物理力場的作用使各組分分配于來同區(qū)域而達(dá)到分離目的，如電泳，超速離心，超濾等。

在所有這些方法的應(yīng)用中必須注意保存生物大分子的完整性，防止酸、堿、高溫，劇烈機(jī)械作用而導(dǎo)致所提物質(zhì)生物活性的喪失。蛋白質(zhì)的制備一般分為以下四個階段：選擇材料和預(yù)處理，細(xì)胞的破碎及細(xì)胞器的分離，提取和純化，濃細(xì)、干燥和保存。

微生物、植物和動物都可做為制備蛋白質(zhì)的原材料，所選用的材料主要依據(jù)實驗?zāi)康膩泶_定。對于微生物，應(yīng)注意它的生長期，在微生物的對數(shù)生長期，酶和核酸的含量較高，可以獲得高產(chǎn)量，以微生物為材料時有兩種情況：（1）得用微生物菌體分泌到培養(yǎng)基中的代謝產(chǎn)物和胞外酶等；（2）利用菌體含有的生化物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸和胞內(nèi)酶等。

植物材料必須經(jīng)過去殼，脫脂并注意植物品種和生長發(fā)育狀況不同，其中所含生物大分子的量變化很大，另外與季節(jié)性關(guān)系密切。對動物組織，必須選擇有效成份含量豐富的臟器組織為原材料，先進(jìn)行絞碎、脫脂等處理。

另外，對預(yù)處理好的材料，若不立即進(jìn)行實驗，應(yīng)冷凍保存，對于易分解的生物大分子應(yīng)選用新鮮材料制備。蛋白質(zhì)的分離純化 一，蛋白質(zhì)（包括酶）的提取 大部分蛋白質(zhì)都可溶于水、稀鹽、稀酸或堿溶液，少數(shù)與脂類結(jié)合的蛋白質(zhì)則溶于乙醇、丙酮、丁醇等有機(jī)溶劑中，因些，可采用不同溶劑提取分離和純化蛋白質(zhì)及酶。

（一）水溶液提取法 稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。

一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。但另一方面，溫度升高會使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質(zhì)和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。

為了避免蛋白質(zhì)提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。

1、pH值 蛋白質(zhì)，酶是具有等電點的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點兩側(cè)的pH 范圍內(nèi)。用稀酸或稀堿提取時，應(yīng)防止過酸或過堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。

2、鹽濃度 稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。

升濃度為宜。緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。

（二）有機(jī)溶劑提取法 一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必須在低溫下操作。

丁醇提取法對提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。

二、蛋白質(zhì)的分離純化 蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析 中性鹽對蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。鹽析時若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點則效果更好。

由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。 影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。

一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。

（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來（共沉現(xiàn)象）。

因此在鹽析前血清要加。

5.酶分離純化主要包括哪些步驟,其目的分別是什么

這是一門很深的學(xué)問，除了需要高科技還需要科研專用設(shè)備，只是簡介，希望對你有幫助，不要上當(dāng)受騙：酶的分離純化方法簡介 生物細(xì)胞產(chǎn)生的酶有兩類：一類由細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后分泌到細(xì)胞外進(jìn)行作用的酶，稱為細(xì)胞外酶。

這類酶大都是水解酶，如酶法生產(chǎn)葡萄糖所用的兩種淀粉酶，就是由枯草桿菌和根酶發(fā)酵過程中分泌的。這類酶一般含量較高，容易得到；另一類酶在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生后并不分泌到細(xì)胞外，而在細(xì)胞內(nèi)起催化作用，稱為細(xì)胞內(nèi)酶，如檸檬酸、肌苷酸、味精的發(fā)酵生產(chǎn)所進(jìn)行的一系列化學(xué)反應(yīng)，就是在多種酶催化下在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行的，在類酶在細(xì)胞內(nèi)往往與細(xì)胞結(jié)構(gòu)結(jié)合，有一定的分布區(qū)域，催化的反應(yīng)具有一定的順序性，使許多反應(yīng)能有條不紊地進(jìn)行。

酶的來源多為生物細(xì)胞。生物細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的總的酶量雖然是很高的，但每一種酶的含量卻很低，如胰臟中期消化作用的水解酶種類很多，但各種酶的含量卻差別很大。

因此，在提取某一種酶時，首先應(yīng)當(dāng)根據(jù)需要，選擇含此酶最豐富的材料，如胰臟是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。由于從動物內(nèi)臟或植物果實中提取酶制劑受到原料的限制，如不能綜合利用，成本又很大。

目前工業(yè)上大多采用培養(yǎng)微生物的方法來獲得大量的酶制劑。從微生物中來生產(chǎn)酶制劑的優(yōu)點有很多，既不受氣候地理條件限制，而且動植物體內(nèi)酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，產(chǎn)酶量又豐富，還可以通過選育菌種來提高產(chǎn)量，用廉價原料可以大量生產(chǎn)。

由于在生物組織中，除了我們所需要的某一種酶之外，往往還有許多其它酶和一般蛋白質(zhì)以及其他雜質(zhì)，因此為制取某酶制劑時，必須經(jīng)過分純化的手續(xù)。酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)，蛋白質(zhì)很容易變性，所以在酶的提純過程中應(yīng)避免用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，保持在較低的溫度下操作。

在提純的過程中通過測定酶的催化活性可以比較容易跟蹤酶在分離提純過程中的去向。酶的催化活性又可以作為選擇分離純化方法和操作條件的指標(biāo)，在整個酶的分離純化過程中的每一步驟，始終要測定酶的總活力和比活力，這樣才能知道經(jīng)過某一步驟回收到多少酶，純度提高了多少，從而決定著一步驟的取舍。

酶的分離純化一般包括三個基本步驟：即抽提、純化、結(jié)晶或制劑。首先將所需的酶從原料中引入溶液，此時不可避免地夾帶著一些雜質(zhì)，然后再將此酶從溶液中選擇性地分離出來，或者從此溶液中選擇性地除去雜質(zhì)，然后制成純化的酶制劑。

下面就酶的分離純化的常用方法作一綜合介紹：一、預(yù)處理及固液分離技術(shù)1.細(xì)胞破碎（celldisruption） 高壓均質(zhì)器法：此法可用于破碎酵母菌、大腸菌、假單胞菌、桿菌甚至黑曲霉菌。將細(xì)胞懸浮液在高壓下通入一個孔徑可調(diào)的排放孔中，菌體從高壓環(huán)境轉(zhuǎn)到低壓環(huán)境，細(xì)胞就容易破碎。

菌懸液一次通過均質(zhì)器的細(xì)胞破碎率在12%-67%。細(xì)胞破碎率與細(xì)胞的種類有關(guān)。

要達(dá)到90%以上的細(xì)胞破碎率，起碼要將菌懸液通過均質(zhì)器兩次。最好是提高操作壓力，減少操作次數(shù)。

但有人報道，當(dāng)操作壓力達(dá)到175mpa時，破碎率可達(dá)100%。當(dāng)壓力超過70mpa時，細(xì)胞破碎率上升較為緩慢。

高壓均質(zhì)器的閥門是影響細(xì)胞破碎率的重要因素。絲狀菌會堵塞均質(zhì)器的閥門，尤其高濃度菌體時更是如此。

在豐富培養(yǎng)基上比在合成培養(yǎng)基上生長的大腸菌更難破碎。容菌酶處理法：蛋清中含有豐富的溶菌酶，價格便宜，常用來裂解細(xì)胞。

具體做法是：溶壁微球菌（）43kg，置于0.5%的氯化鈉溶液中，使細(xì)胞濃度為5%（干重），在35℃用0.68kg（干重）的蛋清處理20min，得到的細(xì)胞碎片用相同體積的乙醇處理，用離心機(jī)將細(xì)胞碎片和胞內(nèi)蛋白質(zhì)除去，再將乙醇濃度提高到75%（體積分?jǐn)?shù)），可以得到純度為5%的過氧化氫酶1500g。2.離心 離心分離過程可分為離心過濾、離心沉淀、離心分離3種類型，所使用的設(shè)備有過濾式離心機(jī)、沉降式離心機(jī)和離心機(jī)。

過濾式離心機(jī)的轉(zhuǎn)鼓壁上開有小孔，壁上有過濾介質(zhì)，一般可用于處理懸浮固體顆粒較大、固體含量較高的場合。沉降式離心機(jī)用于分離固體濃度較低的固液分離，如發(fā)酵液中的菌體，用鹽析法或有機(jī)溶劑處理過的蛋白質(zhì)等。

分離機(jī)用于分離兩種互不相溶的、密度有微小差別的乳濁液或含微量固體微粒的乳濁液。在生物領(lǐng)域采用的離心機(jī)系統(tǒng)，除了應(yīng)具備離心機(jī)的一般要求外，還應(yīng)滿足生物生產(chǎn)的技術(shù)要求，這包括滅菌、冷卻、密封，以保證產(chǎn)品不受污染并不污染環(huán)境。

現(xiàn)代哦離心機(jī)裝置包括以下三個步驟，并進(jìn)行程序控制：離心、離心系統(tǒng)的滅菌及就地清洗。如阿法-拉伐公司離心機(jī)產(chǎn)品的裝置，具有雙重軸向密封，密封由裝在轉(zhuǎn)筒主軸上下的碳化硅動環(huán)和固定環(huán)組成，密封由水連續(xù)冷卻和潤滑，可防止產(chǎn)品被污染，也可防止生產(chǎn)過程中排出的廢物對環(huán)境的污染。

該離心機(jī)又如一個密閉的壓力容器，可在121℃溫度下進(jìn)行蒸汽滅菌，該離心設(shè)備設(shè)有環(huán)繞離心機(jī)轉(zhuǎn)筒的冷卻夾套，對懸浮液和濃縮的固體都能進(jìn)行充分的冷卻，并能有效地控制溫度，這對于生物制品是非常重要的。如btpx205型離心機(jī)可用于細(xì)胞收集、培養(yǎng)液的凈化和細(xì)胞碎片的分離，可用于疫苗、酶制劑等的。

6.酶分離純化的主要技術(shù)措施有哪些

酶是蛋白質(zhì)，因此一般蛋白質(zhì)的分離原則都應(yīng)該遵行。

但酶作為特殊的蛋白質(zhì)，最重要的原則是一定在純化過程中保持酶的活性，所以純化過程中一般要注意保持低溫、緩沖液配方避免酶的抑制。每個步驟都要檢測酶活性，一方面直觀了解純化的回收率，另一方面可以計算酶的純度。

酶的分離純化方法一般根據(jù)酶的分子量、等電點、疏水性等生化性質(zhì)，選擇相應(yīng)的沉淀、鹽析、層析方法，其中親和層析可以應(yīng)用可逆性底物作為配基或特異性抗體，制備親和層析膠。酶的分離純化工作主要是，將酶從雜蛋白中分離出來或者將雜蛋白從酶溶液中除去。

現(xiàn)有的酶分離純化方法都是依據(jù)酶和雜蛋白在性質(zhì)上的差異而建立的。 1、根據(jù)分子大小而設(shè)計的方法，如離心分離法、篩膜分離法、凝膠過濾法等。

2、根據(jù)溶解度的大小分離的方法，如鹽析法，有機(jī)溶劑沉淀法，共沉淀法。