QPCR的化學(xué)方法(qPCR實(shí)驗(yàn)操作流程誰(shuí)知道)

1.qPCR實(shí)驗(yàn)操作流程誰(shuí)知道

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Q-PCR實(shí)驗(yàn)流程

一、①實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備，每天早上到實(shí)驗(yàn)室后，先把超凈工作臺(tái)的紫外燈打開15-20分鐘。②超凈臺(tái)前做實(shí)驗(yàn)，需佩戴干凈的橡膠手套/一次性薄膜手套，RNA抽提需帶口罩。③取EP管/槍頭時(shí)需用鑷子，不可以用使用過(guò)的手套直接取用。取完EP管/槍頭后，袋子及時(shí)封好。④橡膠手套須放入超凈臺(tái)照射紫外，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中不得帶出超凈臺(tái)，移液器在一天工作結(jié)束后調(diào)至最大量程，并用75%乙醇清潔移液器，槍頭盒及超凈臺(tái)面。⑤實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的過(guò)程中或觀看實(shí)驗(yàn)時(shí)，沒有帶口罩不要在超凈臺(tái)前講話。

二、總RNA抽提

1）細(xì)胞培養(yǎng)皿中細(xì)胞樣品用1*PBS洗兩次后，用1ml槍將PBS吸干凈，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，吹打混勻，并吸至1.5ml RNase free EP管中使細(xì)胞充分裂解，室溫靜置5min;

組織樣品用液氮充分研磨，加入1ml Trizol (Invitrogen)溶液，混勻，室溫放置5min使其充分裂解；（管蓋與管壁都需標(biāo)記樣品名稱）

2）加入200μl氯仿，劇烈振蕩混勻30s，使水相和有機(jī)相充分接觸，室溫靜置3-5min；（離心時(shí)離心管按順序排放，離心完畢，離心管的順序也按順序排好，與第一步的順序一致）

3) 4℃下，14,000g離心15min，可見分為三層，RNA在上層水相，移至另一個(gè)新的RNase free EP管；（用20-200ul的槍吸取上清，吸上清時(shí)，槍頭應(yīng)沿著液面上層吸取上清，槍頭不可碰到、吸到中間層）

4）沉淀RNA：加入等體積異丙醇，輕柔地充分混勻（顛倒6-8次）（不應(yīng)用振蕩器混勻），室溫靜置10min;

5)4℃下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀（如離心后仍不見EP管底部有沉淀，應(yīng)將EP管放置在-80度冰箱過(guò)夜，繼續(xù)在4℃下，14,000g離心10min，收集RNA沉淀），去上清；

6）用75%乙醇洗滌兩次（12,000g離心5min）（加入乙醇后只需輕輕顛倒EP管即可，不用振蕩器震蕩或槍頭吸打沉淀），超凈臺(tái)風(fēng)干；沉淀不能過(guò)干或過(guò)濕，過(guò)干則不易溶解，過(guò)濕則乙醇?xì)埩簟?/p>

7）視沉淀量加入適量DEPC水（至少15ul）溶解沉淀。

可以去詳細(xì)了解 please click to connect

三、去基因組

使用RNase-free的DNase ?（Promega），按以下體系配置反應(yīng)液，37℃消化30min,65℃滅活10min。

2.幫忙解釋一下qPCR和FISH的原理

百度百科里有：

Realtime PCR（實(shí)時(shí)定量PCR）

定量PCR已經(jīng)從基于凝膠的低通量分析發(fā)展到高通量的熒光分析技術(shù)，即實(shí)時(shí)定量PCR。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國(guó)Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。實(shí)時(shí)定量PCR (real-time quantitative PCR)是指在PCR指數(shù)擴(kuò)增期間通過(guò)連續(xù)監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)強(qiáng)弱的變化來(lái)即時(shí)測(cè)定特異性產(chǎn)物的量，并據(jù)此推斷目的基因的初始量，不需要取出PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離。目前實(shí)時(shí)定量PCR作為一個(gè)極有效的實(shí)驗(yàn)方法，已被廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)的主要應(yīng)用：

1. DNA 或RNA 的絕對(duì)定量分析：包括病原微生物或病毒含量的檢測(cè)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)的檢測(cè)，RNAi 基因失活率的檢測(cè)等

2. 基因表達(dá)差異分析：例如比較經(jīng)過(guò)不同處理樣本之間特定基因的表達(dá)差異（如藥物處理、物理處理、化學(xué)處理等 ），特定基因在不同時(shí)相的表達(dá)差異以及cDNA 芯片或差顯結(jié)果的確證

3. 基因分型：例如SNP 檢測(cè)，甲基化檢測(cè)等

Realtime PCR 常用的兩種方法分別為：Sybr green（熒光染料摻入法） 和Taqman probe （探針法）

SYBR green

在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。

此方法適用：

1、靈敏度高：使用SYBR可使熒光效果增強(qiáng)到1000倍以上

2、通用性好，不需要設(shè)計(jì)探針，方法簡(jiǎn)便，省時(shí)，價(jià)格低廉。

3、通用型方法，在國(guó)內(nèi)外科研中普遍使用。

4、高通量大規(guī)模的定量PCR檢測(cè)

5、專一性要求不高的定量PCR檢測(cè)。

Taqman Probe

PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'-3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步

此方法適用：

1、具有高適應(yīng)性和可靠性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果穩(wěn)定重復(fù)性好，特異性更高。

2、適用于擴(kuò)增序列專一的體系的檢測(cè)。

3、樣品中靶基因含量過(guò)低的定量PCR檢測(cè)。

4、靶基因的特異序列較短，無(wú)論怎樣優(yōu)化引物設(shè)計(jì)條件都不能解決。

5、存在與靶基因同源的序列，在PCR中容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，對(duì)特異性要求較高的定量。

6、廣泛用于人類傳染病的診斷和病原定量，在動(dòng)物病原體基因的檢測(cè)，畜禽產(chǎn)品的檢驗(yàn)檢疫，生物制品的鑒定。

（來(lái)源：GENELIFE Biotech 基萊生物）

3.請(qǐng)問什么叫QPCR

QPCR 問：什么是QPCR？答：QPCR的英文全名是Real-time Quantitative PCR Detecting System。

即實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)系統(tǒng)，也叫實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)，簡(jiǎn)稱QPCR。問：QPCR、DNA檢測(cè)、PCR之間的關(guān)系？答：聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction簡(jiǎn)稱PCR）原理憑借敏感、特異、快速的特點(diǎn)榮獲93年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

因其在病原體檢測(cè)方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，因而發(fā)達(dá)國(guó)家在相關(guān)方法和儀器方面的研發(fā)非?？欤蔀榉肿由飳W(xué)診斷的主流，至今仍處于學(xué)術(shù)和應(yīng)用前沿：第一代產(chǎn)品：基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀（DNA Thermal Cycler）+電泳儀+紫外分析儀+定性試劑，構(gòu)成PCR定性檢測(cè)。第二代產(chǎn)品：基因擴(kuò)增熱循環(huán)儀+熒光儀+終點(diǎn)定量試劑，構(gòu)成PCR-DNA終點(diǎn)法定量檢測(cè)（End-point quantitative PCR detection），又分為終點(diǎn)酶免定量（ End-point ELISA-PCR）和終點(diǎn)熒光定量（End-point Fluor-PCR）兩種。

第三代產(chǎn)品：實(shí)時(shí)定量QPCR儀+實(shí)時(shí)熒光定量試劑，構(gòu)成QPCR-DAN/RNA實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。問：相比以前的方法，QPCR有哪些特點(diǎn)？答：QPCR至少有以下特點(diǎn)：所用儀器少，只用一臺(tái)儀器。

檢測(cè)時(shí)間短，只須45分鐘~1小時(shí)10分鐘（試劑各異），而定性PCR須3~4小時(shí)，酶免終點(diǎn)定量須6~8小時(shí)，熒光終點(diǎn)定量須2~3小時(shí)。操作極其簡(jiǎn)單：前處理后，樣本插入儀器一小時(shí)后到電腦上來(lái)出報(bào)告即可，無(wú)須開蓋，移樣本（以前方法），避免污染。

結(jié)果精確：定性PCR只能定性，很粗略，終點(diǎn)定量PCR由于只能在40個(gè)熱循環(huán)結(jié)束后檢測(cè)熒光，被測(cè)熒光達(dá)到飽和導(dǎo)致定量不夠精確，屬于半定量狀態(tài)。而實(shí)時(shí)熒光QPCR是在擴(kuò)增的每時(shí)每刻連續(xù)檢測(cè)各樣本的熒光值的變化，如圖一所示： 圖一 西安天隆TL988實(shí)際曲線1檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍：10~10000000000 DNA copies/ml檢測(cè)精度：0.1RLU辨別率：5000和10,000個(gè)模板拷貝樣本的辨別率99.7%。

問：QPCR的技術(shù)先進(jìn)性、價(jià)格及應(yīng)用現(xiàn)狀？答：實(shí)時(shí)熒光QPCR是當(dāng)今世界用于臨床的最先進(jìn)核酸分子診斷技術(shù)，被美國(guó)FDA承認(rèn)并推崇，被美國(guó)FDA批準(zhǔn)并取得臨床應(yīng)用執(zhí)照的QPCR試劑品種有：HBV乙肝病毒DNA,HCV丙肝病毒RNA,HIV艾滋病病毒RNA,Chlamydi trachomatis(CT)，性傳播疾病，沙眼衣原體，Neiserria gonorrhea(NG)，性傳播疾病，淋病雙球菌，Cytomegalovirus(CMV)，性傳播疾病，巨細(xì)胞病毒，Mybobacterium tuberculosis(Mtb)，呼吸道疾病，結(jié)核分支桿菌等。實(shí)時(shí)熒光PCR儀研發(fā)技術(shù)難度大，門檻高，發(fā)達(dá)國(guó)家也只有有限幾家知名公司生產(chǎn)，且售價(jià)昂貴：如美國(guó)ABI/7700-120萬(wàn)元，美國(guó)ABI/5700-50萬(wàn)元，瑞士Roche/Lightcycler-70萬(wàn)元，美國(guó)Stratagene公司2005年新品MX3005P-80萬(wàn)元 可見，在病人看來(lái)，哪家醫(yī)院應(yīng)用了QPCR技術(shù)便是先進(jìn)診斷技術(shù)的象征，在發(fā)達(dá)國(guó)家也是如此。

國(guó)產(chǎn)儀器情況：國(guó)產(chǎn)儀器生產(chǎn)單位不超過(guò)五家，其中包括：日本獨(dú)資杭州博日實(shí)時(shí)熒光QPCR儀（33孔）西安天隆科技有限公司TL988實(shí)時(shí)熒光QPCR儀（48孔） 以上產(chǎn)品均取得國(guó)家SFDA認(rèn)證，報(bào)價(jià)均在45萬(wàn)以上。 國(guó)產(chǎn)試劑情況：多家公司生產(chǎn)實(shí)時(shí)熒光QPCR試劑盒，價(jià)格與終點(diǎn)法試劑相當(dāng)，且品種齊全，價(jià)格便宜，購(gòu)買方便：乙肝HBV-DNA，丙肝HCV-RNA，艾滋AIDSHIV-RNA，性病系列：淋病雙球菌NG、沙眼衣原體CT、解脲支原體UU、皰疹病毒HSV、人體乳頭瘤HPV，優(yōu)生優(yōu)育系列：巨細(xì)胞病毒CMV、弓形蟲COX等。

編輯詞條 開放分類：病毒、DNA、PCR、分子生物、實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 參考資料： 1. /pcr%D2%C7 2. 貢獻(xiàn)者：zhang120jing、弦之月NONO。

4.定量分析方法有哪些

有五種，分別是：

1、比率分析法。根據(jù)不同數(shù)據(jù)做對(duì)比，得出比率。

2、趨勢(shì)分析法。根據(jù)一階段某一指標(biāo)的變動(dòng)繪制趨勢(shì)分析圖。

3、結(jié)構(gòu)分析法。根據(jù)某一指標(biāo)占總體的百分比來(lái)觀察。

4、相互對(duì)比法。選取某兩個(gè)指標(biāo)作為一組進(jìn)行對(duì)比。

5、數(shù)學(xué)模型法。建造適合某一指標(biāo)的數(shù)學(xué)模型來(lái)觀察指標(biāo)的變化。

以上五種定量分析方法，比率分析法是基礎(chǔ)，趨勢(shì)分析、結(jié)構(gòu)分析和對(duì)比分析等方法是延伸，數(shù)學(xué)模型法代表了定量分析的發(fā)展方向。

拓展資料：

定量分析法（quantitative analysis method）是對(duì)社會(huì)現(xiàn)象的數(shù)量特征、數(shù)量關(guān)系與數(shù)量變化進(jìn)行分析的方法。在企業(yè)管理上，定量分析法是以企業(yè)財(cái)務(wù)報(bào)表為主要數(shù)據(jù)來(lái)源，按照某種數(shù)理方式進(jìn)行加工整理，得出企業(yè)信用結(jié)果。定量分析是投資分析師使用數(shù)學(xué)模塊對(duì)公司可量化數(shù)據(jù)進(jìn)行的分析，通過(guò)分析對(duì)公司經(jīng)營(yíng)給予評(píng)價(jià)并做出投資判斷。定量分析的對(duì)象主要為財(cái)務(wù)報(bào)表，如資金平衡表、損益表、留存收益表等。其功能在于揭示和描述社會(huì)現(xiàn)象的相互作用和發(fā)展趨勢(shì)。

百度百科-定量分析

5.化學(xué)檢測(cè)的方法有哪些

化學(xué)檢測(cè)的方法有哪些

一般分有機(jī)顏料，如酞青綠等；無(wú)機(jī)顏料如氧化鐵紅、鈦白；染料如還原桃紅、分散橙等.聚烯烴、PVC色母粒采用的是顏料，一般說(shuō)染料不可用于聚烯烴著色，否則會(huì)引起嚴(yán)重遷移.

二、分散劑主要對(duì)顏料表面進(jìn)行潤(rùn)濕，有利于顏料進(jìn)一步分散，并穩(wěn)定在樹脂中，同時(shí)必須與樹脂相容性好，不影響著色產(chǎn)品品質(zhì).聚烯烴色母粒分散劑一般采用低分子量聚乙烯蠟或硬酯酸鋅等.工程塑料色母粒分散劑一般采用有極性低分子量聚乙烯蠟、硬酯酸鎂、硬酯酸鈣等.三、載體樹脂

使顏料均勻分布并使色母粒呈顆粒狀.選擇載體需考慮與被著色樹脂的相容性，還要考慮母粒應(yīng)有良好分散性，因此載體的流動(dòng)性應(yīng)大于被著色樹脂，同時(shí)被著色后不影響產(chǎn)品質(zhì)量.如選用熔體指數(shù)較大的同類高聚物，使母粒的熔體指數(shù)較高于被著高聚物，以保證最終制品的色澤一致.

6.分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)的分析方法有哪些

如果你指的是定量分析化學(xué)，分析方法有重量法和滴定法

重量法包括沉淀重量法、氣化法、電解法、萃取法等，重量分析方法適合于常量分析，相對(duì)誤差較小，但操作繁瑣，耗時(shí)較長(zhǎng)。

滴定法包括酸堿滴定、配合滴定、氧化還原滴定、沉淀滴定四種方法。該方法簡(jiǎn)便、快速、有足夠的準(zhǔn)確度，相對(duì)誤差較小，主要用于常量組分測(cè)定，但需要特定的指示劑。

有時(shí)候吸光光度法也被劃入化學(xué)分析的范疇，主要是因?yàn)槲舛葴y(cè)定前通常需要一個(gè)配合顯色的過(guò)程，這是一個(gè)化學(xué)過(guò)程。