馬卡斯亮藍(lán)溶液使用(考馬斯亮藍(lán)G)
1.考馬斯亮藍(lán)G
考馬斯亮藍(lán)與蛋白質(zhì)結(jié)合是一個(gè)很快的過(guò)程，約2 min即可反應(yīng)完全，呈現(xiàn)最大光吸收，并可穩(wěn)定1 h。之后，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物發(fā)生聚合并沉淀出來(lái)。一般在反應(yīng)5min后開始測(cè)定。
選用的標(biāo)準(zhǔn)品預(yù)先用凱氏定氮法準(zhǔn)確測(cè)得蛋白純度，然后根據(jù)需要，用NaCl溶液或蒸餾水配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液（含標(biāo)準(zhǔn)蛋白100μg/mL）。
最好用去離子水配制試劑。
先將考馬斯亮藍(lán)配制成母液（低溫下可長(zhǎng)期放置），工作液要現(xiàn)用現(xiàn)配。都避光、低溫保存。
做標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)，其回歸方程的相關(guān)系數(shù)應(yīng)達(dá)到3個(gè)9（即r值至少為0.999），標(biāo)準(zhǔn)曲線方可用。試劑或儀器更換，一定重新做標(biāo)準(zhǔn)曲線。
測(cè)定樣品的條件一定要與做標(biāo)準(zhǔn)曲線的條件相一致。
蛋白糖化物對(duì)考馬斯亮藍(lán)法存在干擾，因此，應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定含糖基蛋白的制品時(shí)需進(jìn)一步改進(jìn)。
去污劑（如 Triton X-100、SDS）,Tris,NaOH，植物樣品中的酚類、有機(jī)酸等，是常見(jiàn)的干擾物。
試驗(yàn)中所需器皿一定要干凈、干燥，各試液取量一定要準(zhǔn)確。
2.考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度,具體步驟有哪些,需要什么試劑
該方法用于大多數(shù)蛋白質(zhì)的定量是比較精確的，但不適用于小分子堿性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過(guò)0.2%影響測(cè)定結(jié)果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1.Bradford濃染液的配制：將100mg考馬斯亮藍(lán)G-250溶于50m1 95%乙醇，加入100ml濃磷酸，然后，用蒸餾水補(bǔ)充至200ml，此染液放4℃至少6個(gè)月保持穩(wěn)定。
2.標(biāo)準(zhǔn)曲線蛋白質(zhì)樣本的準(zhǔn)備：盡量使用與待測(cè)樣本性質(zhì)相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)品，例如測(cè)定抗體，可用純化的抗體作為標(biāo)準(zhǔn)。如果待測(cè)樣本是未知的，也可用抗體作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
3.將待測(cè)樣本溶于100~1緩沖溶液中，該緩沖溶液應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的緩沖溶液相同（最好用PBS）。
4.按1:5用蒸餾水稀釋濃染料結(jié)合溶液，如出現(xiàn)沉淀，過(guò)濾除去。
5.每個(gè)樣本加5ml稀釋的染料結(jié)合溶液，作用5~30rain。染液與蛋白質(zhì)結(jié)合后，將由紅色變?yōu)樗{(lán)色，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定其吸光度。注意，顯色反應(yīng)不得超過(guò)30min.
6.根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算待測(cè)樣本的濃度。
注意：
考馬斯亮藍(lán)和皮膚中蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，反應(yīng)快速，并且穩(wěn)定，無(wú)法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細(xì)胞自然衰老脫落即可無(wú)礙
三、考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白質(zhì)含量—標(biāo)準(zhǔn)曲線制作
（一）、試劑：
1、考馬斯亮藍(lán)試劑：
考馬斯亮藍(lán)G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，雍蒸餾水稀釋至1000ml，濾紙過(guò)濾。最終試劑中含0.01%(W/V)考馬斯亮藍(lán)G—250,4.7%(W/V)乙醇，8.5%(W/V)H3PO4。
2、標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液：
純的牛血清血蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測(cè)定蛋白氮含量，根據(jù)其純度同0.15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
（二）、器材：
1、722S型分光光度計(jì)使用及原理（）。
2、移液管使用（）。
（三）、標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：
試管編號(hào) 0 1 2 3 4 5 6
100ug/ml標(biāo)準(zhǔn)蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考馬斯亮藍(lán)試劑 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
搖勻，1h內(nèi)以1號(hào)管為空白對(duì)照，在595nm處比色
A595nm
1、
2、以A595nm為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)蛋白含量為橫坐標(biāo)（六個(gè)點(diǎn)為10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐標(biāo)軸上繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1）、利用標(biāo)準(zhǔn)曲線查出回歸方程。
2）、用公式計(jì)算回歸方程。
3）、或用origin作圖 ，測(cè)出回歸線性方程。即A595nm=a*X( )+6
一般相關(guān)系數(shù)應(yīng)過(guò)0.999以上，至少2個(gè)9以上。
4）、繪圖時(shí)近兩使點(diǎn)在一條直線上，在直線上的點(diǎn)應(yīng)該在直線兩側(cè)。
（四）、蛋白質(zhì)含量的測(cè)定：
樣品即所測(cè)蛋白質(zhì)含量樣品（含量應(yīng)處理在所測(cè)范圍內(nèi)），依照操作步驟1操作，測(cè)出樣品的A595nm，然后利用標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。
一般被測(cè)樣品的A595nm值在0.1—0.05之間，所以上述樣品如果A595nm值太大，可以稀釋后再測(cè)A595nm值，然后再計(jì)算。
（五）、注意事項(xiàng)：
1、玻璃儀器要洗滌干凈。
2、取量要準(zhǔn)確。
3、玻璃儀器要干燥，避免溫度變化。
4、對(duì)照：用被測(cè)物質(zhì)以外的物質(zhì)作空白對(duì)照。
