trizol提rna(想請(qǐng)教用過(guò)Trizol法提取RNA,且結(jié)果比較理想的詳細(xì)步驟及注意事項(xiàng))
1.想請(qǐng)教用過(guò)Trizol法提取RNA,且結(jié)果比較理想的詳細(xì)步驟及注意事項(xiàng)
我這邊剛好在做，給你說(shuō)下：
貼壁細(xì)胞的話去培養(yǎng)液，PBS洗一遍，加Trizol吹打下來(lái)。組織的話，在液氮里面搗碎，然后粉末放進(jìn)Trizol，用超聲粉碎器粉碎（超聲每3秒，停10秒冷卻，直到看不見(jiàn)組織碎末）。
（此步驟可以-80oC凍存，下面可以以后再做）
每1毫升Trizol加200微升氯仿（氯仿需飽和，可以在氯仿加一兩公分高的水層，搖晃后靜置分層，用時(shí)到下層取氯仿）
使出吃奶的勁把Trizol氯仿混合液搖成渾濁的乳液，每個(gè)樣起碼狂搖30秒（用手拿著，不能用漩渦混勻器）
靜置3分鐘，分層，進(jìn)4度離心機(jī)，14000轉(zhuǎn)15-30分鐘。
取上層無(wú)色清澈液體，進(jìn)新管。槍尖絕對(duì)不能貼壁，絕對(duì)不能碰觸到極薄的乳白固態(tài)中間層，絕對(duì)不能吸到下層的紅色液體。假定是1毫升Trizol200微升氯仿的量，你這里取個(gè)400-500微升就可以偷笑了，千萬(wàn)別貪心，造成污染。
加相等體積異丙醇，倒置數(shù)次混勻，不用太激烈。
（次步驟又可以-80oC凍存，下面可以以后再做）
進(jìn)4度離心機(jī)，14000轉(zhuǎn)10分鐘，這個(gè)時(shí)候可以看見(jiàn)小沉淀物了，白色，看不見(jiàn)的話，產(chǎn)量就悲劇了。
棄上清，用1毫升75%酒精洗兩次（加酒精，手搖看到沉淀物游來(lái)游去就可以了，然后離心棄上清）酒精盡量吸干凈，但槍尖不要碰到沉淀物。
蓋子打開(kāi)，在通風(fēng)櫥里面晾干（一般5-10分鐘?？吹匠恋砦飶陌咨儼胪该骶挖s快停了，干過(guò)頭了等下難以溶解）
加干凈的水（沒(méi)有核酸酶的，你懂的）10-50微升依你產(chǎn)量而定啦。55oC水浴5-10分鐘充分溶解。
大功告成，可以測(cè)濃度和各項(xiàng)指標(biāo)，分裝，凍存了。
如果需要用DNAse去DNA，加在異丙醇步驟前即可。
2.Trizol法提取RNA操作步驟
動(dòng)植物總RNA提取-Trizol法 Trizol法適用于人類、動(dòng)物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細(xì)菌，樣品量從幾十毫克至幾克。
用Trizol法提取的總RNA絕無(wú)蛋白和DNA污染。RNA可直接用于Northern斑點(diǎn)分析，斑點(diǎn)雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯，RNase封阻分析和分子克隆。
1、將組織在液N中磨成粉末后，再以50-100mg組織加入1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過(guò)所用Trizol體積的10%。 2、研磨液室溫放置5分鐘，然后以每1mlTrizol液加入0。
2ml的比例加入氯仿，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管15秒。 3、取上層水相于一新的離心管，按每mlTrizol液加0。
5ml異丙醇的比例加入異丙醇，室溫放置10分鐘，12000g離心10分鐘。 4、棄去上清液，按每ml Trizol液加入至少1ml的比例加入75%乙醇，渦旋混勻，4℃下7500g離心5分鐘。
5、小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥5-10分鐘，注意不要干燥過(guò)分，否則會(huì)降低RNA的溶解度。然后將RNA溶于水中，必要時(shí)可55℃-60℃水溶 10分鐘。
RNA可進(jìn)行mRNA分離，或貯存于70%乙醇并保存于-70℃。 [注意] 1、整個(gè)操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個(gè)月以上，RNA沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。 。
3.用trizol法提取RNA的方法及每一步的原理.
實(shí)驗(yàn)步驟：1. 提取組織RNA時(shí)，每50~100mg組織用1ml Trizol試劑對(duì)組織進(jìn)行裂解：提取細(xì)胞RNA時(shí)，先離心沉淀細(xì)胞，每5~106個(gè)細(xì)胞加1ml Trizol后，反復(fù)用槍吹打或劇烈震蕩以裂解細(xì)胞；2. 將上述組織或細(xì)胞的Trizol裂解液轉(zhuǎn)入EP管中，在試問(wèn)15~30℃下放置5分鐘；3. 在上述EP管中，按照每1mlTrizol后加0.2ml氯仿的量加入氯仿，蓋上EP管蓋子，在手中用力震蕩15秒，在室溫下（15~30℃）放置2~3分鐘后，12000g(2~8℃)離心15分鐘；4. 去上層水相置于新EP管中，按照每1mlTrizol加0.5ml異丙醇的量加入異丙醇，在室溫下（15~30℃）放置10分鐘后，12000g(2~8℃)離心10分鐘；5. 棄上清，按照每1ml Trizol加1ml75% 乙醇進(jìn)行洗滌，渦旋混合，7500g(2~8℃)離心5分鐘，棄上清；6. 讓沉淀的RNA在室溫在自然干燥；7. 用Rnase-free water 溶解RNA沉淀各試劑的作用：1、TRIZOL主要成分是苯酚。
苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8-羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來(lái)抑制內(nèi)源和外源RNase(RNA酶)。
TRIZOL是從細(xì)胞和組織中提取總RNA的即用型試劑，在樣品裂解或勻漿過(guò)程中，TRIZOL能保持RNA完整性。加入氯仿后，溶液分為水相和有機(jī)相，RNA在水相中。
取出水相，用異丙醇可沉淀回收RNA?！?.1%的8-羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。
※異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離?！?巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。
2、氯仿為有機(jī)溶劑與水互不相溶，RNA（核糖核“酸”的鹽型）是離子化合物，溶于水相3、異丙醇能與與任意比例的水混合，因此加入異丙醇，能夠奪取RNA/DNA周圍的水分，RNA/DNA能夠聚集而發(fā)生沉淀。
