pcr檢測(PCR實驗操作注意事項有哪些)
1.PCR實驗操作注意事項有哪些
1、必須在無菌無塵環(huán)境下進行操作；
2、檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書；
3、必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實驗室；
4、后PCR區(qū)PCR完成以后，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。
擴展資料
PCR實驗特點：
1、靈敏度高：PCR實驗產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的，能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞；在病毒的檢測中，PCR的靈敏度可達3個RFU；在細(xì)菌學(xué)中最小檢出率為3個細(xì)菌。
2、簡便、快速：PCR實驗反應(yīng)一般在2~4 小時完成擴增反應(yīng)。擴增產(chǎn)物一般用電泳分析，不一定要用同位素，無放射性污染、易推廣。
3、純度要求低：不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞，DNA 粗制品及RNA均可作為擴增模板?？芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴增檢測。
參考資料來源：百度百科-PCR實驗室
2.PCR的操作注意事項
PCR操作注意事項：
1.從少量樣品（1-10mg組織或102-104細(xì)胞）中提取RNA時可加入少許糖原以促進RNA沉淀。例如加800ml TRIzol勻漿樣品，沉淀RNA前加5-10μg RNase-free糖原。糖原會與RNA一同沉淀出來，糖原濃度不高于4mg/ml是不影響第一鏈的合成，也不影響PCR反應(yīng)。
2.勻漿后加氯仿之前樣品可以在-60至-70℃保存至少一個月。RNA沉淀可以保存于75% 酒精中2-8℃一星期以上或-5至-20℃一年以上。
3.分層和RNA沉淀時也可使用臺式離心機，2600*g離心30-60分鐘。
預(yù)期產(chǎn)量：1mg組織或1*106細(xì)胞提取RNA分別為：
肝和脾6-10μg ，腎3-4μg，骨骼肌和腦組織1-1.5μg，胎盤1-4μg，上皮細(xì)胞8-15μg，成纖維細(xì)胞5-7μg
3.在PCR擴增實驗中應(yīng)注意什么?
PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間 一般為48h以內(nèi)，有些最好于當(dāng)日電泳檢測，大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失。
假陰性，不出現(xiàn)擴增條帶 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備，②引物的質(zhì)量與特異性，③酶的質(zhì)量及， ④PCR循環(huán)條件。尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
模板：①模板中含有雜蛋白質(zhì)，②模板中含有Taq酶抑制劑，③模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白，④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。⑤模 板核酸變性不徹底。
在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標(biāo)本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng) 固定不宜隨意更改。 酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。
需注意的是有時忘加Taq酶或溴乙錠。 引物：引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不 理想、容易彌散的常見原因。
有些批號的引物合成質(zhì)量有問題，兩條引物一條濃度 高，一條濃度低，造成低效率的不對稱擴增，對策為：①選定一個好的引物合成單 位。②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。
如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。
④引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。 Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高可降低PCR擴增的特 異性，濃度過低則影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
反應(yīng)體積的改變：通常進行PCR擴增采用的體積為20ul、30ul、50ul。或100ul，應(yīng)用多 大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定，在做小體積如20ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。
物理原因：變性對PCR擴增來說相當(dāng)重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計，檢測一下擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度，這也是PCR失敗的原因之一。
靶序列變異：如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合，或因靶序列某 段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的。 假陽性 出現(xiàn)的PCR擴增條帶與目的靶序列條帶一致，有時其條帶更整齊，亮度更高。
引物設(shè)計不合適：選擇的擴增序列與非目的擴增序列有同源性，因而在進行PCR擴增時，擴增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出現(xiàn)假陽性。
需重新設(shè)計引物。 靶序列或擴增產(chǎn)物的交叉污染：這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染，導(dǎo)致假陽性。
這種假陽性可用以下方法解決：操作時應(yīng)小心輕柔，防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或濺出離心管外。除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外，所有試劑或器材均應(yīng)高壓消毒。
所用離心管及樣進槍頭等均應(yīng)一次性使用。必要時，在加標(biāo)本前，反應(yīng)管和試劑用紫外線照射，以破壞存在的核酸。
二是空氣中的小片段核酸污染，這些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，與引物互補后，可擴增出PCR產(chǎn)物，而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生，可用巢式PCR方法來減輕或消除。
出現(xiàn)非特異性擴增帶 PCR擴增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計的大小不一致，或大或小，或者同時出現(xiàn)特異性擴增帶 與非特異性擴增帶。非特異性條帶的出現(xiàn)，其原因：一是引物與靶序列不完全互補、或引物聚合形成二聚體。
二是Mg2+離子濃度過高、退火溫度過低，及PCR循環(huán)次數(shù) 過多有關(guān)。其次是酶的質(zhì)和量，往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶 則不出現(xiàn)，酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴增。
其對策有：必要時重新設(shè)計引 物。減低酶量或調(diào)換另一來源的酶。
降低引物量，適當(dāng)增加模板量，減少循環(huán)次 數(shù)。適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點法（93℃變性，65℃左右退火與延伸）。
出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶 PCR擴增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶。其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量 差，dNTP濃度過高，Mg2+濃度過高，退火溫度過低，循環(huán)次數(shù)過多引起。
其對策有：減少酶量，或調(diào)換另一來源的酶。②減少dNTP的濃度。
適當(dāng)降低Mg2+濃 度。增加模板量，減少循環(huán)次數(shù)。
4.RT
在做Northern等雜交實驗、構(gòu)建cDNA文庫、獲取能夠編碼真核生物蛋白的基因、獲得RNA病毒基因時，會用到RNA提取和RT-PCR技術(shù)。
真核生物的基因組是DNA，為什么不直接從DNA PCR得到我們需要的基因呢？因為真核生物的基因含有大量的非編碼區(qū)，稱為內(nèi)元（intron），真正編碼蛋白的區(qū)段是被這些內(nèi)元隔開的，這些編碼區(qū)叫做外元（exon）。真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄成為RNA之后，經(jīng)過剪切和拼接，去掉這些非編碼區(qū)，才形成成熟的mRNA，由mRNA再翻譯成蛋白質(zhì)。
所以，如果直接從真核生物的基因組DNA獲取目的基因，克隆再表達，試圖獲取目的蛋白的思路是行不通的，因為獲取的DNA里面會含有非編碼區(qū)。要表達真核生物的基因并表達出相應(yīng)的蛋白，只能通過提取其mRNA并RT-PCR這條頗費周折的途徑。
1.RNA的提取 RNA的提取其實原理很簡單：通過變性劑破碎細(xì)胞或者組織，然后經(jīng)過氯仿等有機溶劑抽提RNA，再經(jīng)過沉淀，洗滌，晾干，最后溶解。但是由于RNA酶無處不在，隨時可能將RNA降解，所以實驗中有很多地方需要注意，稍有疏忽就會前功盡棄。
1.1 分離高質(zhì)量RNA 成功的cDNA合成來自高質(zhì)量的RNA。高質(zhì)量的RNA至少應(yīng)保證全長并且不含逆轉(zhuǎn)錄酶的抑制劑，如EDTA或SDS。
RNA的質(zhì)量決定了你能夠轉(zhuǎn)錄到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA純化方法是使用異硫氰酸胍/酸性酚的一步法。
一般不必使用oligo(dT)選擇性分離poly(A)+RNA。不管起始模板是總RNA還是poly(A)+ RNA，都可以檢測到擴增結(jié)果。
另外，分離poly(A)+RNA會導(dǎo)致樣品間mRNA豐度的波動變化，從而使信息的檢出和定量產(chǎn)生偏差。然而，當(dāng)分析稀有mRNA時，poly(A)+RNA會增加檢測的靈敏度。
1.2 RNA提取的最大影響因素-RNA酶 在所有RNA實驗中，最關(guān)鍵的因素是分離得到全長的RNA。而實驗失敗的主要原因是核糖核酸酶（RNA酶）的污染。
由于RNA酶廣泛存在而穩(wěn)定，可耐受多種處理而不被滅活，如煮沸、高壓滅菌等，RNA酶催化的反應(yīng)一般不需要輔助因子。因而RNA制劑中只要存在少量的RNA酶就會引起RNA在制備與分析過程中的降解，而所制備的RNA的純度和完整性又可直接影響RNA分析的結(jié)果，所以RNA的制備與分析操作難度極大。
在實驗中，一方面要嚴(yán)格控制外源性RNA酶的污染；另一方面要最大限度地抑制內(nèi)源性的RNA酶。外源性的RNA酶存在于操作人員的手汗、唾液等，也可存在于灰塵中。
在其它分子生物學(xué)實驗中使用的RNA酶也會造成污染。這些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、電泳槽、研究人員的手及各種試劑。
而各種組織和細(xì)胞中則含有大量內(nèi)源性的RNA酶。 1.3 常用的RNA酶抑制劑 *焦碳酸二乙酯（DEPC）：是一種強烈但不徹底的RNA酶抑制劑。
它通過和RNA酶的活性基團組氨酸的咪唑環(huán)結(jié)合使蛋白質(zhì)變性，從而抑制酶的活性。 *異硫氰酸胍：目前被認(rèn)為是最有效的RNA酶抑制劑，它在裂解組織的同時也使RNA酶失活。
它既可破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)使核酸從核蛋白中解離出來，又對RNA酶有強烈的變性作用。 *氧釩核糖核苷復(fù)合物：由氧化釩離子和核苷形成的復(fù)合物，它和RNA酶結(jié)合形成過渡態(tài)類物質(zhì)，幾乎能完全抑制RNA酶的活性。
*RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin）：從大鼠肝或人胎盤中提取得來的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一種非競爭性抑制劑，可以和多種RNA酶結(jié)合，使其失活。
*其它：SDS、尿素、硅藻土等對RNA酶也有一定抑制作用。 1.4 防止RNA酶污染的措施、RNA提取之前需要注意和準(zhǔn)備的工作 *盡可能在實驗室專門辟出RNA操作區(qū)，離心機、移液器、試劑等均應(yīng)專用。
RNA操作區(qū)應(yīng)保持清潔，并定期進行除菌。 *操作過程中應(yīng)始終戴一次性橡膠手套和口罩，并經(jīng)常更換，以防止手、臂上的細(xì)菌和真菌以及人體自身分泌的RNase帶入各種容器內(nèi)或污染用具。
盡量避免使用一次性塑料手套。塑料手套不僅常常給操作帶來不便，而且塑料手套的多出部分常常將器具有RNase處傳遞到RNase-free處，擴大污染。
*盡量使用一次性的塑料制品，避免共用器具如濾紙、tips、tubes等，以防交叉污染。例如，從事RNA探針工作的研究者經(jīng)常使用RNase H、T1等，在操作過程中極有可能造成移液器、離心機等的污染。
而這些污染了的器具是RNA操作的大敵。 *關(guān)于一次性塑料制品，建議使用廠家供應(yīng)的出廠前已經(jīng)滅菌的tips和tubes等。
多數(shù)廠家供應(yīng)的無菌塑料制品很少有RNase污染，買來后可直接用于RNA操作。用DEPC等處理的塑料制品，往往由于二次污染而帶有RNase，從而導(dǎo)致實驗失敗。
*所有的玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180℃的高溫下干烤6hr或更長時間。 *無法用DEPC處理的用具可用氯仿擦拭若干次，這樣通?？梢韵齊Nase的活性。
*配制溶液用的乙醇、異丙醇、Tris等應(yīng)采用未開封的新瓶裝試劑。 *塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗（注意：有機玻璃器具因可被氯仿腐蝕，故不能使用）。
*有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干。 *配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37℃處理。
5.在PCR擴增實驗中應(yīng)注意什么
1. 引物的質(zhì)量是保證PCR特異性的關(guān)鍵，引物過長或過短均會使特異性降低，以18~30bp為宜；引物中C+G含量宜在50%左右；引物內(nèi)部和引物之間不應(yīng)含有互補序列；引物的堿基順序與非擴增區(qū)域的同源性應(yīng)小于70%；引物的3'末端與模板DNA一定要配對，但末端沒有嚴(yán)格的限制，故引物設(shè)計時可在5'末端加上限制性內(nèi)切酶位點和/或啟動密碼ATG等；引物合成后必須純化以去除合成產(chǎn)物中的不完整序列、脫嘌呤產(chǎn)物、堿基修飾鏈等“雜質(zhì)”；引物的終濃度一般為0.2~0.5μmol/L，過低會影響反應(yīng)產(chǎn)量，過高會增加引物二聚或錯配的幾率。
2. Taq DNA聚合酶具有5'→3'聚合酶活性和5'→3'外切酶活性，但無3'-5'外切酶活性，因此對單核苷酸的錯配無校正功能，發(fā)生堿基錯配的幾率為 2.1*10-4左右。然而Taq DNA聚合酶的優(yōu)勢在于反應(yīng)產(chǎn)量高于其他DNA聚合酶。
Stratagene推出的Pfu DNA聚合酶一直是研究人員心目中最好的高保真酶，而Pfu DNA聚合酶經(jīng)基因工程改造后，新創(chuàng)出的Pfu Ultra具有更佳的校驗活力。數(shù)據(jù)顯示Pfu UltraTM高保真DNA聚合酶的平均錯配率為Pfu DNA聚合酶的1/3，為Taq DNA聚合酶的1/18，是目前保真度最高的PCR酶（保真度=1/錯誤率） （數(shù)據(jù)來源：美國冷泉港實驗室）。
3. Mg2+濃度也是影響反應(yīng)效率和特異性的重要因素之一。Taq DNA聚合酶對Mg2+濃度非常敏感，Mg2+可與模板DNA、引物及dNTP等的磷酸根結(jié)合，不同反應(yīng)體系中應(yīng)適當(dāng)調(diào)整MgCl2的濃度，一般以比 dNTP總濃度高出0.5~1.0mmol/L為宜，Mg2+過量能增加非特異擴增。
4. dNTP的濃度過高會增加堿基的錯誤摻入率，使反應(yīng)特異性下降；過低則會導(dǎo)致反應(yīng)速度下降。使用時4種dNTP必須以等當(dāng)量濃度配制，均衡的dNTP有利于減少錯配誤差和提高使用效率。
5. 溫度循環(huán)參數(shù)中應(yīng)特別注意復(fù)性溫度，它決定引物與模板的特異性結(jié)合。退火復(fù)性溫度可根據(jù)引物的長度，通過Tm=4(G+C)+2(A+T) 計算得到。
在Tm允許的范圍內(nèi)，選擇較高的退火溫度可大大減少引物與模板之間的非特異結(jié)合。6. 減低污染的常規(guī)措施：①將PCR試劑、PCR產(chǎn)物及其他分子生物學(xué)試劑分開放置；②應(yīng)保持樣品制備、PCR反應(yīng)液配制與PCR產(chǎn)物分析三個工作區(qū)的獨立性；③使用陽性和陰性對照；④使用最高質(zhì)量的水配制PCR實驗的所有反應(yīng)試劑；⑤配制好的PCR反應(yīng)試劑應(yīng)分成小包裝儲存，每個包裝僅用于單次實驗；⑥制備樣品、配制試劑及反應(yīng)液時必須戴手套；⑦實驗前一定要認(rèn)真清潔加樣器等。
