基因工程轉(zhuǎn)化方法(基因工程中轉(zhuǎn)化的方法)
1.基因工程中轉(zhuǎn)化的方法有哪些
通過轉(zhuǎn)化將載體DNA導(dǎo)入受體菌繼而得到含有目的DNA插入的轉(zhuǎn)化菌株是構(gòu)建DNA文庫(kù)最為關(guān)鍵的一步。
化學(xué)法（化學(xué)藥物如氯化鈣等）轉(zhuǎn)化
氯化鈣法轉(zhuǎn)化細(xì)胞 細(xì)菌處于0℃及CaCl2低滲溶液中時(shí)，菌細(xì)胞膨脹成球形。轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸復(fù)合物粘附于細(xì)胞表面，經(jīng)42℃短時(shí)間熱擊處理促進(jìn)細(xì)胞吸收DNA復(fù)合物。
直接分離基因最常用的方法是“鳥槍法”，又叫“散彈射擊法”。具體做法：用限制酶將供體細(xì)胞中的DNA切成許多片段，將這些片段分別載入運(yùn)載體，然后通過運(yùn)載體分別載人不同的受體細(xì)胞，讓供體細(xì)胞所提供的DNA（外源DNA）的所有片段分別在各個(gè)受體細(xì)胞中大量復(fù)制（在遺傳學(xué)中叫擴(kuò)增），從中找出含有目的基因的細(xì)胞，再用一定的方法把帶有目的基因的DNA片段分離出來。但這種方法工作量大，具有一定的盲目性。20世紀(jì)80年代以后，隨著DNA核苷酸序列分析技術(shù)的發(fā)展，人們已經(jīng)可以通過DNA序列自動(dòng)測(cè)序儀對(duì)提取出的基因進(jìn)行核苷酸序列分析，并且通過一種擴(kuò)增DNA的新技術(shù)（也叫PCR技術(shù)），使目的基因片段在短時(shí)間內(nèi)成百萬(wàn)倍地?cái)U(kuò)增。上述新技術(shù)的出現(xiàn)大大簡(jiǎn)化了基因工程的操作技術(shù)。
2.轉(zhuǎn)基因技術(shù)的轉(zhuǎn)化方法
遺傳轉(zhuǎn)化的方法按其是否需要通過組織培養(yǎng)、再生植株通常可分成兩大類，第一類需要通過組織培養(yǎng)再生植株，常用的方法有農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍法；另一類方法不需要通過組織培養(yǎng)，比較成熟的主要有花粉管通道法，花粉管通道法是中國(guó)科學(xué)家提出的。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌是普遍存在于土壤中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌，它能在自然條件下趨化性地感染大多數(shù)雙子葉植物的受傷部位，并誘導(dǎo)產(chǎn)生冠癭瘤或發(fā)狀根。根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌中細(xì)胞中分別含有Ti質(zhì)粒和Ri質(zhì)粒，其上有一段T-DNA，農(nóng)桿菌通過侵染植物傷口進(jìn)入細(xì)胞后，可將T-DNA插入到植物基因組中。
因此，農(nóng)桿菌是一種天然的植物遺傳轉(zhuǎn)化體系。人們將目的基因插入到經(jīng)過改造的T-DNA區(qū)，借助農(nóng)桿菌的感染實(shí)現(xiàn)外源基因向植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與整合，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出轉(zhuǎn)基因植株。
農(nóng)桿菌介導(dǎo)法起初只被用于雙子葉植物中，自從技術(shù)瓶頸被打破之后，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化在單子葉植物中也得到了廣泛應(yīng)用，其中水稻已經(jīng)被當(dāng)作模式植物進(jìn)行研究。花粉管通道法在授粉后向子房注射含目的基因的DNA溶液，利用植物在開花、受精過程中形成的花粉管通道，將外源DNA導(dǎo)入受精卵細(xì)胞，并進(jìn)一步地被整合到受體細(xì)胞的基因組中，隨著受精卵的發(fā)育而成為帶轉(zhuǎn)基因的新個(gè)體。
該方法于80年代初期由中國(guó)學(xué)者周光宇提出，中國(guó)目前推廣面積最大的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用花粉管通道法培育出來的。該法的最大優(yōu)點(diǎn)是不依賴組織培養(yǎng)人工再生植株，技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要裝備精良的實(shí)驗(yàn)室，常規(guī)育種工作者易于掌握。
核顯微注射法核顯微注射法是動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)中最常用的方法。它是在顯微鏡下將外源基因注射到受精卵細(xì)胞的原核內(nèi)，注射的外源基因與胚胎基因組融合，然后進(jìn)行體外培養(yǎng)，最后移植到受體母畜子宮內(nèi)發(fā)育，這樣分娩的動(dòng)物體內(nèi)的每一個(gè)細(xì)胞都含有新的DNA片段。
-這種方法的缺點(diǎn)是效率低、位置效應(yīng)（外源基因插入位點(diǎn)隨機(jī)性）造成的表達(dá)結(jié)果的不確定性、動(dòng)物利用率低等，在反芻動(dòng)物還存在著繁殖周期長(zhǎng)，有較強(qiáng)的時(shí)間限制、需要大量的供體和受體動(dòng)物等特點(diǎn)。詳細(xì)步驟：在顯微鏡下，用一根極細(xì)的玻璃針（直徑1-2微米）直接將DNA注射到胚胎的細(xì)胞核內(nèi)，再把注射過DNA的胚胎移植到動(dòng)物體內(nèi)，使之發(fā)育成正常的幼仔。
用這種方法生產(chǎn)的動(dòng)物約有十分之一是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。基因槍法利用火藥爆炸或高壓氣體加速（這一加速設(shè)備被稱為基因槍），將包裹了帶目的基因的DNA溶液的高速微彈直接送入完整的植物組織和細(xì)胞中，然后通過細(xì)胞和組織培養(yǎng)技術(shù)，再生出植株，選出其中轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株即為轉(zhuǎn)基因植株。
與農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化相比，基因槍法轉(zhuǎn)化的一個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)是不受受體植物范圍的限制。而且其載體質(zhì)粒的構(gòu)建也相對(duì)簡(jiǎn)單，因此也是轉(zhuǎn)基因研究中應(yīng)用較為廣泛的一種方法。
精子介導(dǎo)法精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移是把精子作適當(dāng)處理后，使其具有攜帶外源基因的能力。然后，用攜帶有外源基因的精子給發(fā)情母畜授精。
在母畜所生的后代中，就有一定比例的動(dòng)物是整合外源基因的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。同顯微注射方法相比，精子介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：首先是它的成本很低，只有顯微注射法成本的1/10。
其次，由于它不涉及對(duì)動(dòng)物進(jìn)行處理，因此，可以用生產(chǎn)牛群或羊群進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以保證每次實(shí)驗(yàn)都能夠獲得成功。核移植轉(zhuǎn)基因法體細(xì)胞核移植是一種轉(zhuǎn)基因技術(shù)。
該方法是先把外源基因與供體細(xì)胞在培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使外源基因整合到供體細(xì)胞上，然后將供體細(xì)胞細(xì)胞核移植到受體細(xì)胞——去核卵母細(xì)胞，構(gòu)成重建胚，再把其移植到假孕母體，待其妊娠、分娩，便可得到轉(zhuǎn)基因的克隆動(dòng)物。體細(xì)胞核移植法先在體外培養(yǎng)的體細(xì)胞中進(jìn)行基因?qū)耄Y選獲得帶轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞。
然后，將帶轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞核移植到去掉細(xì)胞核的卵細(xì)胞中，生產(chǎn)重構(gòu)胚胎。重構(gòu)胚胎經(jīng)移植到母體中，產(chǎn)生的仔畜百分之百是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。
3.基因工程包括哪些步驟
基因工程的主要操作步驟包括：⑴目的基因的制備，所謂目的基因就是按照設(shè)計(jì)所需要轉(zhuǎn)移的具有遺傳效應(yīng)的DNA片段。
目的基因可以人工合成，也可以用限制性核酸內(nèi)切酶從基因組中直接切割得到。⑵目的基因與克隆載體的重組，所謂克隆載體就是承載和保護(hù)目的基因帶入受體細(xì)胞的運(yùn)載者，如質(zhì)粒，λ噬菌體，病毒等。
⑶重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞，所謂受體細(xì)胞就是接受外源目的基因的細(xì)胞，大腸桿菌是用得最多的原核細(xì)胞受體，另外，動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞都可作為受體細(xì)胞，把帶有目的基因的重組體轉(zhuǎn)入受體細(xì)胞要用到各種物理的、化學(xué)的和生物的方法。⑷克隆子的篩選和鑒定，帶有目的基因的克隆子有沒有組合到受體細(xì)胞的基因組中去，目的基因有沒有在宿主細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)錄、翻譯表達(dá)出預(yù)先設(shè)計(jì)中想要得到的產(chǎn)物和表達(dá)產(chǎn)物如何分離、純化等技術(shù)內(nèi)容。
