分離蛋白質混合物實驗方法(分離蛋白質混合物的方法主要是根據蛋白質在溶液中的哪些性質)
1.分離蛋白質混合物的方法主要是根據蛋白質在溶液中的哪些性質
（一）水溶液提取法 稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質的溶解.提取的溫度要視有效成份性質而定.一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間.但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作.為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）.下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇.1、pH值 蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH 范圍內.用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液.2、鹽濃度 稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用.同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾.升濃度為宜.緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液.（二）有機溶劑提取法 一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必須在低溫下操作.丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活.另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料.二、蛋白質的分離純化 蛋白質的分離純化方法很多，主要有：（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法1、蛋白質的鹽析 中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出.鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好.由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節(jié)混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀.影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行.一般溫度低蛋白質溶介度降低.但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析.（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低.（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來（共沉現象）.因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%.蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等. 其中應用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性.硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節(jié).蛋白質在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行.此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短.2、等電點沉淀法 蛋白質在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用.3、低溫有機溶劑沉淀法 用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行.（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開.超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質.2、凝膠過濾法 也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）.（三）根據蛋白質帶電性質進行分離 蛋白質在不同pH環(huán)境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開.1、電泳法 各種蛋白質在同一pH條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不。
2.蛋白質分離純化的四種方法
1、鹽析法：
鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚并從溶液中析出。
2、有機溶劑沉淀法：
有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。
3、蛋白質沉淀劑：
蛋白質沉淀劑僅對一類或一種蛋白質沉淀起作用，常見的有堿性蛋白質、凝集素和重金屬等。
4、聚乙二醇沉淀作用：
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發(fā)生沉淀作用。
擴展資料：
蛋白質是生命的物質基礎，是有機大分子，是構成細胞的基本有機物，是生命活動的主要承擔者。沒有蛋白質就沒有生命。氨基酸是蛋白質的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動緊密聯系在一起的物質。
機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與。蛋白質占人體重量的16%~20% ，即一個60kg重的成年人其體內約有蛋白質9.6~12kg。
人體內蛋白質的種類很多，性質、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，并在體內不斷進行代謝與更新。
參考資料來源：百度百科-蛋白質分離純化
3.蛋白質的分離方法有哪些
1.根據分子大小不同進行分離純化 蛋白質是一種大分子物質，并且不同蛋白質的分子大小不同，因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開，并使蛋白質混合物也得到分離。
根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。
透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜，而蛋白質被截留在半透膜上的過程。
這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用，在進行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。
由于超濾過程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。
當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如，在從大米渣中提取蛋白質的實驗中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進行預處理后，再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。
使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度（區(qū)帶）離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產品純度高但產量偏低。
蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析，是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。
凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時，比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。
在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質（88∶12）、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。
2.根據溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度，根據蛋白質分子結構的特點，適當地改變外部條件，就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度，達到分離純化蛋白質的目的。
常用的方法有等電點沉淀和pH值調節(jié)、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。 等電點沉淀和pH值調節(jié)是最常用的方法。
每種蛋白質都有自己的等電點，而且在等電點時溶解度最低；相反，有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質。
王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發(fā)現，pH值為時茶葉蛋白提取效果最好，提取率達到36·8%，初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4，使目標蛋白于等電點沉淀出來。
等電點沉淀法還應用于葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。
他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質，得到了最佳的提取工藝為：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃攪拌40 min，葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11]。
利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白，蛋白質產率高達90%[12]。 蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象，其中，增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶，反之為鹽析。
應當指出，同樣濃度的二價離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對蛋白質溶解度影響的效果，要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質，其最佳提取工藝是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃攪拌提取30min，蛋白質提取率為57·25%[10]。
鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應用于生產。由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對蛋白質的破壞，應用氨水調pH值至中性。
為防止不同分子之間產生共沉淀現象，蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純后，通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。
有機溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機溶劑（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下，引起蛋白質沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此，控制有機溶劑的。
4.常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種
分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大?。?）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉淀：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從溶液中沉淀析出，稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時，溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質沉淀.2、電泳法：蛋白質分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負或正電荷，因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決于蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質，可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用于測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法，蛋白質溶液加于柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質進入孔內，因而在柱中滯留時間較長，大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出，因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同，經超速離心后，分布于不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量，蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.。
5.試述蛋白質分離的常用方法
/b389713/d45708250.htm（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統的水溶液對蛋白質穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時需要均勻的攪拌，以利于蛋白質的溶解。
提取的溫度要視有效成份性質而定。一方面，多數蛋白質的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時間。
但另一方面，溫度升高會使蛋白質變性失活，因此，基于這一點考慮提取蛋白質和酶時一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質提以過程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質，酶是具有等電點的兩性電解質，提取液的pH值應選擇在偏離等電點兩側的pH范圍內。
用稀酸或稀堿提取時，應防止過酸或過堿而引起蛋白質可解離基團發(fā)生變化，從而導致蛋白質構象的不可逆變化，一般來說，堿性蛋白質用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進蛋白質的溶，稱為鹽溶作用。
同時稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質部分結合，具有保護蛋白質不易變性的優(yōu)點，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。
緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機溶劑提取法一些和脂質結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必須在低溫下操作。丁醇提取法對提取一些與脂質結合緊密的蛋白質和酶特別優(yōu)越，一是因為丁醇親脂性強，特別是溶解磷脂的能力強；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內（度為10%,40度為6.6%）不會引起酶的變性失活。
另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動植物及微生物材料。二、蛋白質的分離純化蛋白質的分離純化方法很多，主要有：（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法1、蛋白質的鹽析中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續(xù)升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質膠粒凝結并沉淀析出。
鹽析時若溶液pH在蛋白質等電點則效果更好。由于各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節(jié)混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉淀。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。
但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。
（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉淀出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在2.5-3.0%。
蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點是溫度系數小而溶解度大（25度時飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。
硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當用其他pH值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節(jié)。蛋白質在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。
此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。2、等電點沉淀法蛋白質在靜電狀態(tài)時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節(jié)溶液的pH達到某一蛋白質的等電點使之沉淀，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉淀法用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。
超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。2、凝膠過濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。
柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexged）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。（三）根據蛋白質帶電性質進行分離蛋白質在不同pH環(huán)境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
6.常用的蛋白質分離純化方法有哪幾種
分離蛋白質混合物的各種方法主要是根據蛋白質在溶液中的以下性質：1）分子大??；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質；5）對其它分子的生物學親和力等進行分離.常見的分離提純蛋白質的方法有：1、鹽析與有機溶劑沉淀：在蛋白質溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質的膠體性質，使蛋白質從溶液中沉淀析出，稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時，溶液的pH在蛋白質的等電點處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質沉淀.2、電泳法：蛋白質分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負或正電荷，因此在電場中可以移動.電泳遷移率的大小主要取決于蛋白質分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質，可將大分子物質與小分子物質分離開.4、層析法：利用混合物中各組分理化性質的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動相）之間的分布不同而進行分離.主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用于測定蛋白質的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過濾法，蛋白質溶液加于柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質進入孔內，因而在柱中滯留時間較長，大分子蛋白質不能進入孔內而徑直流出，因此不同大小的蛋白質得以分離.6、超速離心：利用物質密度的不同，經超速離心后，分布于不同的液層而分離.超速離心也可用來測定蛋白質的分子量，蛋白質的分子量與其沉降系數S成正比.。
