分離蛋白質(zhì)混合物實(shí)驗(yàn)方法(分離蛋白質(zhì)混合物的方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的哪些性質(zhì))
1.分離蛋白質(zhì)混合物的方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的哪些性質(zhì)
（一）水溶液提取法 稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解.提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定.一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間.但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作.為了避免蛋白質(zhì)提以過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）.下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇.1、pH值 蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH 范圍內(nèi).用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液.2、鹽濃度 稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用.同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾.升濃度為宜.緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液.（二）有機(jī)溶劑提取法 一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液.但必須在低溫下操作.丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%,40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活.另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料.二、蛋白質(zhì)的分離純化 蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析 中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出.鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好.由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀.影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行.一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低.但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析.（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低.（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）.因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%.蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等. 其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性.硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié).蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行.此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短.2、等電點(diǎn)沉淀法 蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用.3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法 用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行.（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾 透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi).超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì).2、凝膠過(guò)濾法 也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一.柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）.（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離 蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開(kāi).1、電泳法 各種蛋白質(zhì)在同一pH條件下，因分子量和電荷數(shù)量不同而在電場(chǎng)中的遷移率不。
2.蛋白質(zhì)分離純化的四種方法
1、鹽析法：
鹽析法的根據(jù)是蛋白質(zhì)在稀鹽溶液中，溶解度會(huì)隨鹽濃度的增高而上升，但當(dāng)鹽濃度增高到一定數(shù)值時(shí)，使水活度降低，進(jìn)而導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質(zhì)分子間互相凝聚并從溶液中析出。
2、有機(jī)溶劑沉淀法：
有機(jī)溶劑能降低蛋白質(zhì)溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機(jī)溶劑的介電常數(shù)比水小，導(dǎo)致溶劑的極性減小。
3、蛋白質(zhì)沉淀劑：
蛋白質(zhì)沉淀劑僅對(duì)一類或一種蛋白質(zhì)沉淀起作用，常見(jiàn)的有堿性蛋白質(zhì)、凝集素和重金屬等。
4、聚乙二醇沉淀作用：
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀作用。
擴(kuò)展資料：
蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是有機(jī)大分子，是構(gòu)成細(xì)胞的基本有機(jī)物，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。沒(méi)有蛋白質(zhì)就沒(méi)有生命。氨基酸是蛋白質(zhì)的基本組成單位。它是與生命及與各種形式的生命活動(dòng)緊密聯(lián)系在一起的物質(zhì)。
機(jī)體中的每一個(gè)細(xì)胞和所有重要組成部分都有蛋白質(zhì)參與。蛋白質(zhì)占人體重量的16%~20% ，即一個(gè)60kg重的成年人其體內(nèi)約有蛋白質(zhì)9.6~12kg。
人體內(nèi)蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，但都是由20多種氨基酸（Amino acid）按不同比例組合而成的，并在體內(nèi)不斷進(jìn)行代謝與更新。
參考資料來(lái)源：百度百科-蛋白質(zhì)分離純化
3.蛋白質(zhì)的分離方法有哪些
1.根據(jù)分子大小不同進(jìn)行分離純化 蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡(jiǎn)單的方法使蛋白質(zhì)和小分子物質(zhì)分開(kāi)，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離。
根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進(jìn)行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過(guò)濾等。透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時(shí)常用的方法。
透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進(jìn)行分離。超濾是利用離心力或壓力強(qiáng)行使水和其它小分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過(guò)程。
這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無(wú)機(jī)鹽為主的小分子分開(kāi)。它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進(jìn)行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無(wú)機(jī)鹽。
由于超濾過(guò)程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來(lái)越小。所以在使用超濾方法時(shí)要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過(guò)濾得到更理想的效果 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時(shí)可以利用離心的方法將它們分開(kāi)。例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實(shí)驗(yàn)中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進(jìn)行預(yù)處理后，再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進(jìn)行初步分離[3]。
使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度（區(qū)帶）離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。
可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低。
蔣辰等[6]通過(guò)比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過(guò)濾也稱凝膠滲透層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一。
凝膠過(guò)濾的原理是當(dāng)不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時(shí)，比凝膠珠孔徑大的分子不能進(jìn)入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運(yùn)動(dòng)并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外。目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。
在甘露糖蛋白提純的過(guò)程中使用凝膠過(guò)濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)（88∶12）、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過(guò)濾在抗凝血蛋白的提取過(guò)程中也被用來(lái)除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]。
2.根據(jù)溶解度不同進(jìn)行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)和溫度等。但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)，適當(dāng)?shù)馗淖兺獠織l件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達(dá)到分離純化蛋白質(zhì)的目的。
常用的方法有等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機(jī)溶劑法、雙水相萃取法、反膠團(tuán)萃取法等。 等電點(diǎn)沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法。
每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點(diǎn)，而且在等電點(diǎn)時(shí)溶解度最低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時(shí)很容易溶解。因而可以通過(guò)調(diào)節(jié)溶液的pH值來(lái)分離純化蛋白質(zhì)。
王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過(guò)程發(fā)現(xiàn)，pH值為時(shí)茶葉蛋白提取效果最好，提取率達(dá)到36·8%，初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時(shí)將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4，使目標(biāo)蛋白于等電點(diǎn)沉淀出來(lái)。
等電點(diǎn)沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取。李鳳英等[10]測(cè)得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為3·8。
他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳的提取工藝為：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃攪拌40 min，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達(dá)73·78%。另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11]。
利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質(zhì)無(wú)腥味、色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達(dá)90%[12]。 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象，其中，增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶，反之為鹽析。
應(yīng)當(dāng)指出，同樣濃度的二價(jià)離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對(duì)蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價(jià)離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來(lái)提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃攪拌提取30min，蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10]。
鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對(duì)蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性。
為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行提純后，通常要使用透析或者凝膠過(guò)濾的方法除去中性鹽[13]。
有機(jī)溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機(jī)溶劑（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強(qiáng)度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機(jī)溶劑的濃度不同，因此，控制有機(jī)溶劑的。
4.常用的蛋白質(zhì)分離純化方法有哪幾種
分離蛋白質(zhì)混合物的各種方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的以下性質(zhì)：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質(zhì)；5）對(duì)其它分子的生物學(xué)親和力等進(jìn)行分離.常見(jiàn)的分離提純蛋白質(zhì)的方法有：1、鹽析與有機(jī)溶劑沉淀：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時(shí)，溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質(zhì)沉淀.2、電泳法：蛋白質(zhì)分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負(fù)或正電荷，因此在電場(chǎng)中可以移動(dòng).電泳遷移率的大小主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質(zhì)，可將大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分離開(kāi).4、層析法：利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離.主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過(guò)濾法，蛋白質(zhì)溶液加于柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，因而在柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入孔內(nèi)而徑直流出，因此不同大小的蛋白質(zhì)得以分離.6、超速離心：利用物質(zhì)密度的不同，經(jīng)超速離心后，分布于不同的液層而分離.超速離心也可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比.。
5.試述蛋白質(zhì)分離的常用方法
/b389713/d45708250.htm（一）水溶液提取法稀鹽和緩沖系統(tǒng)的水溶液對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性好、溶解度大、是提取蛋白質(zhì)最常用的溶劑，通常用量是原材料體積的1-5倍，提取時(shí)需要均勻的攪拌，以利于蛋白質(zhì)的溶解。
提取的溫度要視有效成份性質(zhì)而定。一方面，多數(shù)蛋白質(zhì)的溶解度隨著溫度的升高而增大，因此，溫度高利于溶解，縮短提取時(shí)間。
但另一方面，溫度升高會(huì)使蛋白質(zhì)變性失活，因此，基于這一點(diǎn)考慮提取蛋白質(zhì)和酶時(shí)一般采用低溫（5度以下）操作。為了避免蛋白質(zhì)提以過(guò)程中的降解，可加入蛋白水解酶抑制劑（如二異丙基氟磷酸，碘乙酸等）。
下面著重討論提取液的pH值和鹽濃度的選擇。1、pH值蛋白質(zhì)，酶是具有等電點(diǎn)的兩性電解質(zhì)，提取液的pH值應(yīng)選擇在偏離等電點(diǎn)兩側(cè)的pH范圍內(nèi)。
用稀酸或稀堿提取時(shí)，應(yīng)防止過(guò)酸或過(guò)堿而引起蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)發(fā)生變化，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的不可逆變化，一般來(lái)說(shuō)，堿性蛋白質(zhì)用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白質(zhì)用偏堿性的提取液。2、鹽濃度稀濃度可促進(jìn)蛋白質(zhì)的溶，稱為鹽溶作用。
同時(shí)稀鹽溶液因鹽離子與蛋白質(zhì)部分結(jié)合，具有保護(hù)蛋白質(zhì)不易變性的優(yōu)點(diǎn)，因此在提取液中加入少量NaCl等中性鹽，一般以0.15摩爾。升濃度為宜。
緩沖液常采用0.02-0.05M磷酸鹽和碳酸鹽等滲鹽溶液。（二）有機(jī)溶劑提取法一些和脂質(zhì)結(jié)合比較牢固或分子中非極性側(cè)鏈較多的蛋白質(zhì)和酶，不溶于水、稀鹽溶液、稀酸或稀堿中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有機(jī)溶劑，它們具的一定的親水性，還有較強(qiáng)的親脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必須在低溫下操作。丁醇提取法對(duì)提取一些與脂質(zhì)結(jié)合緊密的蛋白質(zhì)和酶特別優(yōu)越，一是因?yàn)槎〈加H脂性強(qiáng)，特別是溶解磷脂的能力強(qiáng)；二是丁醇兼具親水性，在溶解度范圍內(nèi)（度為10%,40度為6.6%）不會(huì)引起酶的變性失活。
另外，丁醇提取法的pH及溫度選擇范圍較廣，也適用于動(dòng)植物及微生物材料。二、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)的分離純化方法很多，主要有：（一）根據(jù)蛋白質(zhì)溶解度不同的分離方法1、蛋白質(zhì)的鹽析中性鹽對(duì)蛋白質(zhì)的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質(zhì)的溶解度增加，此稱鹽溶；當(dāng)鹽濃度繼續(xù)升高時(shí)，蛋白質(zhì)的溶解度不同程度下降并先后析出，這種現(xiàn)象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質(zhì)溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的SO4和NH4）有很強(qiáng)的水化力，可奪取蛋白質(zhì)分子的水化層，使之“失水”，于是蛋白質(zhì)膠粒凝結(jié)并沉淀析出。
鹽析時(shí)若溶液pH在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)則效果更好。由于各種蛋白質(zhì)分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調(diào)節(jié)混合蛋白質(zhì)溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質(zhì)分段沉淀。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對(duì)溫度敏感的蛋白質(zhì)在低溫（4度）操作外，一般可在室溫中進(jìn)行。一般溫度低蛋白質(zhì)溶介度降低。
但有的蛋白質(zhì)（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25度）比0度時(shí)溶解度低，更容易鹽析。（2）pH值：大多數(shù)蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)時(shí)在濃鹽溶液中的溶介度最低。
（3）蛋白質(zhì)濃度：蛋白質(zhì)濃度高時(shí)，欲分離的蛋白質(zhì)常常夾雜著其他蛋白質(zhì)地一起沉淀出來(lái)（共沉現(xiàn)象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質(zhì)含量在2.5-3.0%。
蛋白質(zhì)鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。其中應(yīng)用最多的硫酸銨，它的優(yōu)點(diǎn)是溫度系數(shù)小而溶解度大（25度時(shí)飽和溶液為4.1M，即767克/升；0度時(shí)飽和溶解度為3.9M，即676克/升），在這一溶解度范圍內(nèi)，許多蛋白質(zhì)和酶都可以鹽析出來(lái)；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質(zhì)變性。
硫酸銨溶液的pH常在4.5-5.5之間，當(dāng)用其他pH值進(jìn)行鹽析時(shí)，需用硫酸或氨水調(diào)節(jié)。蛋白質(zhì)在用鹽析沉淀分離后，需要將蛋白質(zhì)中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質(zhì)溶液裝入秀析袋內(nèi)（常用的是玻璃紙），用緩沖液進(jìn)行透析，并不斷的更換緩沖液，因透析所需時(shí)間較長(zhǎng)，所以最好在低溫中進(jìn)行。
此外也可用葡萄糖凝膠G-25或G-50過(guò)柱的辦法除鹽，所用的時(shí)間就比較短。2、等電點(diǎn)沉淀法蛋白質(zhì)在靜電狀態(tài)時(shí)顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)有差別，可利用調(diào)節(jié)溶液的pH達(dá)到某一蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)使之沉淀，但此法很少單獨(dú)使用，可與鹽析法結(jié)合用。
3、低溫有機(jī)溶劑沉淀法用與水可混溶的有機(jī)溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數(shù)蛋白質(zhì)溶解度降低并析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質(zhì)較易變性，應(yīng)在低溫下進(jìn)行。（二）根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小的差別的分離方法1、透析與超濾透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質(zhì)分開(kāi)。
超濾法是利用高壓力或離心力，強(qiáng)使水和其他小的溶質(zhì)分子通過(guò)半透膜，而蛋白質(zhì)留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質(zhì)。2、凝膠過(guò)濾法也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據(jù)分子大小分離蛋白質(zhì)混合物最有效的方法之一。
柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadexged）和瓊脂糖凝膠（agarosegel）。（三）根據(jù)蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)進(jìn)行分離蛋白質(zhì)在不同pH環(huán)境中帶電性質(zhì)和電荷數(shù)量不同，可將其分開(kāi)。
6.常用的蛋白質(zhì)分離純化方法有哪幾種
分離蛋白質(zhì)混合物的各種方法主要是根據(jù)蛋白質(zhì)在溶液中的以下性質(zhì)：1）分子大小；2）溶解度；3）電荷；4）吸附性質(zhì)；5）對(duì)其它分子的生物學(xué)親和力等進(jìn)行分離.常見(jiàn)的分離提純蛋白質(zhì)的方法有：1、鹽析與有機(jī)溶劑沉淀：在蛋白質(zhì)溶液中加入大量中性鹽，以破壞蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)，使蛋白質(zhì)從溶液中沉淀析出，稱為鹽析.常用的中性鹽有：硫酸銨、氯化鈉、硫酸鈉等.鹽析時(shí)，溶液的pH在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)處效果最好.凡能與水以任意比例混合的有機(jī)溶劑，如乙醇、甲醇、丙酮等，均可引起蛋白質(zhì)沉淀.2、電泳法：蛋白質(zhì)分子在高于或低于其pI的溶液中帶凈的負(fù)或正電荷，因此在電場(chǎng)中可以移動(dòng).電泳遷移率的大小主要取決于蛋白質(zhì)分子所帶電荷量以及分子大小.3、透析法：利用透析袋膜的超濾性質(zhì)，可將大分子物質(zhì)與小分子物質(zhì)分離開(kāi).4、層析法：利用混合物中各組分理化性質(zhì)的差異，在相互接觸的兩相（固定相與流動(dòng)相）之間的分布不同而進(jìn)行分離.主要有離子交換層析，凝膠層析，吸附層析及親和層析等，其中凝膠層析可用于測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量.5、分子篩：又稱凝膠過(guò)濾法，蛋白質(zhì)溶液加于柱之頂部，任其往下滲漏，小分子蛋白質(zhì)進(jìn)入孔內(nèi)，因而在柱中滯留時(shí)間較長(zhǎng)，大分子蛋白質(zhì)不能進(jìn)入孔內(nèi)而徑直流出，因此不同大小的蛋白質(zhì)得以分離.6、超速離心：利用物質(zhì)密度的不同，經(jīng)超速離心后，分布于不同的液層而分離.超速離心也可用來(lái)測(cè)定蛋白質(zhì)的分子量，蛋白質(zhì)的分子量與其沉降系數(shù)S成正比.。
