常見的致突變實驗方法(經(jīng)典的致突變實驗)
1.經(jīng)典的致突變實驗有哪些
鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗
又稱Ames試驗，檢測受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株（his-）回復(fù)突變成野生型（his+）的能力。試驗菌株都有組氨酸突變（his-），不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上不能生長，回復(fù)突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養(yǎng)平皿上生長成可見菌落。計數(shù)最低營養(yǎng)平皿上的回變菌落數(shù)來判定受試物是否有致突變性。標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株有四種：TA97和TA98檢測移碼突變、TA100檢測鹼基置換突變、TA102對醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感。這四個試驗菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏感性。
哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗 野生型與突變型果蠅的體色
哺乳動物體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變試驗常用的測試系統(tǒng)有小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞，中國倉鼠肺V79細(xì)胞和卵巢CHO細(xì)胞的三個基因位點的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）、胸苷激酶（TK）及Na+/K+ATP酶（OUA）位點。HGRPT和Na+/K+ATP酶位點突變可用于上述三種細(xì)胞，OUA位點突變僅適用于CHO細(xì)胞，HGRPT和TK可分別使6-硫代鳥嘌呤（6-TG）轉(zhuǎn)移上磷酸核糖及使5-溴脫氧尿苷磷酰化，它們的代謝產(chǎn)物可摻入DNA引起細(xì)胞死亡，因此正常細(xì)胞在含有這些鹼基類似物的培養(yǎng)基中不能生長，在致突變物作用下此兩個位點發(fā)生突變的細(xì)胞對這些鹼基類似物具有抗藥性，可以增殖成為克?。?xì)胞集落）。Na+/K+ATP酶是細(xì)胞膜上的Na+/K泵，鳥本苷可抑制此酶活性引起細(xì)胞死亡，當(dāng)致突變物引起該位點突變后，Na+/K+ATP酶對鳥本苷的親和力下降，而酶活性不變，故對培養(yǎng)基中的鳥本苷產(chǎn)生抗藥性，并可增殖為克隆。
2.致突變試驗的種類有哪些
基因突變試驗1、鼠傷寒沙門氏菌回復(fù)突變試驗又稱Ames試驗，檢測受試物誘發(fā)鼠傷寒沙門氏菌組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變株（his-）回復(fù)突變成野生型（his+）的能力。
試驗菌株都有組氨酸突變（his-），不能自行合成組氨酸，在不含組氨酸的最低營養(yǎng)平皿上不能生長，回復(fù)突變成野生型后能自行合成組氨酸，可在最低營養(yǎng)平皿上生長成可見菌落。 計數(shù)最低營養(yǎng)平皿上的回變菌落數(shù)來判定受試物是否有致突變性。
標(biāo)準(zhǔn)試驗菌株有四種：TA97和TA98檢測移碼突變、TA100檢測鹼基置換突變、TA102對醛、過氧化物及DNA交聯(lián)劑較敏感。這四個試驗菌株除了含有his-突變，還有一些附加突變，以提高敏感性。
試驗方法有點試驗（預(yù)試驗）和摻入試驗（標(biāo)準(zhǔn)試驗）兩種。在摻入試驗中，受試物最高劑量為5mg/皿或出現(xiàn)毒性及沉降的劑量，至少有五個劑量點，并有陰性（溶劑）對照和陽性對照。
將受試物、試驗菌株培養(yǎng)物和S9混合液加到頂層培養(yǎng)基中，混勻后鋪在最低營養(yǎng)平皿上，37℃培養(yǎng)48小時，計數(shù)可見菌落數(shù)。 判斷陽性結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)是，如每皿回變菌落數(shù)為陰性對照的每皿回變菌落數(shù)的兩倍以上，并有劑量-反應(yīng)關(guān)系，即認(rèn)為此受試物為鼠傷寒沙門氏菌的致突變物。
S9混合液是用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿9000Xg上清液（S9）加上NADP及葡萄糖-6-磷酸等輔助因子，作為代謝活化系統(tǒng)。 如不加S9混合液得到陽性結(jié)果，說明受試物是直接致突變物；加S9混合液才得到陽性結(jié)果，說明該受試物是間接致突變物。
只要在一種試驗菌株得到陽性結(jié)果，即認(rèn)為受試物是致突變物；僅當(dāng)四種試驗菌株均得到陰性結(jié)果，才認(rèn)為受試物是非致突變物。2、哺乳動物細(xì)胞基因突變試驗野生型與突變型果蠅的體色哺乳動物體外培養(yǎng)細(xì)胞的基因正向突變試驗常用的測試系統(tǒng)有小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞，中國倉鼠肺V79細(xì)胞和卵巢CHO細(xì)胞的三個基因位點的突變，即次黃嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶（HGPRT）、胸苷激酶（TK）及Na+/K+ATP酶（OUA）位點。
HGRPT和Na+/K+ATP酶位點突變可用于上述三種細(xì)胞，OUA位點突變僅適用于CHO細(xì)胞，HGRPT和TK可分別使6-硫代鳥嘌呤（6-TG）轉(zhuǎn)移上磷酸核糖及使5-溴脫氧尿苷磷酰化，它們的代謝產(chǎn)物可摻入DNA引起細(xì)胞死亡，因此正常細(xì)胞在含有這些鹼基類似物的培養(yǎng)基中不能生長，在致突變物作用下此兩個位點發(fā)生突變的細(xì)胞對這些鹼基類似物具有抗藥性，可以增殖成為克?。?xì)胞集落）。 Na+/K+ATP酶是細(xì)胞膜上的Na+/K泵，鳥本苷可抑制此酶活性引起細(xì)胞死亡，當(dāng)致突變物引起該位點突變后，Na+/K+ATP酶對鳥本苷的親和力下降，而酶活性不變，故對培養(yǎng)基中的鳥本苷產(chǎn)生抗藥性，并可增殖為克隆。
染色體畸變試驗1、染色體分析觀察染色體形態(tài)結(jié)構(gòu)和數(shù)目改變稱為染色體分析。 在國外常稱為細(xì)胞遺傳學(xué)檢驗，但這一名稱有時廣義地包括微核試驗和SCE試驗，因為這兩個試驗同樣也是在顯微鏡下觀察細(xì)胞染色體的改變。
對于結(jié)構(gòu)畸變，一般只觀察到裂隙、斷裂、斷片、微小體、染色體環(huán)、粉碎、雙或多著絲粒染色體和射體。對于缺失，除染色單體缺失外，需作核型分析。
即染色體攝影拍片后，再排列進(jìn)行細(xì)微觀察或用電子計算機(jī)進(jìn)行圖象分析。對于相互易位，除生殖細(xì)胞非同源性染色體相互易位外，倒位、插入、重復(fù)等均需顯帶染色才能發(fā)現(xiàn)。
對于數(shù)目畸變，需在染毒后經(jīng)過一次有絲分裂才能發(fā)現(xiàn)。但是經(jīng)過一次有絲分裂后，一些結(jié)構(gòu)畸變可能因遺傳物質(zhì)的丟失而致細(xì)胞死亡，因此不能發(fā)現(xiàn)。
所以應(yīng)安排多次收獲時間，以便分別檢查斷裂劑的作用。收獲時間的安排還應(yīng)考慮外來化合物可能在細(xì)胞周期的不同時期產(chǎn)生作用，以及延長細(xì)胞周期的作用。
體細(xì)胞的染色體分析可作體內(nèi)或體外試驗，體內(nèi)試驗多觀察骨髓細(xì)胞，體外試驗常用中國倉鼠肺細(xì)胞（CHL），以及中國倉鼠卵細(xì)胞（CHO）和V79等細(xì)胞系，但任何細(xì)胞系的染色體皆不穩(wěn)定，不能準(zhǔn)確地觀察非整倍體，故在體外試驗中，如考慮進(jìn)行染色體數(shù)目觀察，應(yīng)當(dāng)使用原代或早代細(xì)胞，例如人外周淋巴細(xì)胞。 體內(nèi)試驗與人體實際接觸情況相似，但應(yīng)注意受試物或其活性代謝產(chǎn)物有可能不易在骨髓中達(dá)到足夠的濃度。
體外試驗由于受試物與細(xì)胞直接接觸，故往往比體內(nèi)試驗靈敏。2、微核試驗微核試驗經(jīng)致突變物作用后，染色體無著絲點斷片或因紡錘體受損傷而丟失的整個染色體在細(xì)胞分裂的后期仍留在子細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)，成為一個或幾個規(guī)則的次核，稱為微核。
常用嚙齒類動物骨髓嗜多染紅細(xì)胞（PCE）微核試驗。PCE是紅細(xì)胞成熟的一個階段，此時紅細(xì)胞的主核已排出，微核容易辯認(rèn)，PCE胞質(zhì)含RNA染色與成熟紅細(xì)胞易于區(qū)別，故為骨髓微核試驗的首選細(xì)胞群。
常用小鼠，至少設(shè)兩個處理組，最高劑量為LD50/7的80%(LD50/7為在7天內(nèi)使半數(shù)動物死亡的劑量)，另一組為LD50/7的40%，灌胃或腹腔注射，同時設(shè)陰性和陽性對照組，每組至少8只動物，雌雄各半。 給毒方案有多種，如連續(xù)四天，每天一次。
第五天處死，取骨髓，涂片，固定，染色。每鼠計數(shù)1,000個PCE的微核出現(xiàn)率。
當(dāng)經(jīng)適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)分析，處理組微核率顯著高于陰性對照組，并呈現(xiàn)劑量-反應(yīng)關(guān)系時，可認(rèn)。
3.致癌試驗的方法有哪些
致癌試驗一般可分為長期致癌試驗和短期快速篩檢法 長期致癌試驗多于哺乳動物中進(jìn)行，一般多用大鼠、小鼠等嚙齒動物，如條件許可，尚可于狗和猴等一種非嚙齒動物中進(jìn)行。
用完整哺乳動物進(jìn)行的長期致癌試驗結(jié)果可靠，但試驗過程較長，不能在較短時間內(nèi)得出結(jié)論，費(fèi)用也較高，故近年來有許多短期快速方法正在發(fā)展。 短期快速篩檢法較常用方法如下：（1）致突變試驗法：在許多致突變試驗方法中艾姆斯法最為常用，其理論根據(jù)為體細(xì)胞突變是致癌作用的基礎(chǔ)。
根據(jù)艾姆斯法試驗結(jié)果，證實至少有80%的已知致癌物具有致突變作用，但也有不致突變的致癌物（如石棉纖維）和不致癌的致突變物。 由于本法簡便、靈敏，結(jié)果較為可靠，是目前最普遍使用的一種致癌物快速篩檢法。
（2）哺乳動物細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化試驗：將哺乳動物細(xì)胞株于體外與受試物接觸，如受試物有致癌作用，可使正常細(xì)胞在形態(tài)與生理特性方面發(fā)生變化并與癌細(xì)胞相似。此種過程稱為轉(zhuǎn)化，已發(fā)生轉(zhuǎn)化的細(xì)胞稱為轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
細(xì)胞轉(zhuǎn)化并非形成腫瘤，但表示受試物可能具有致癌作用，并可用于致癌物的篩檢。根據(jù)目前經(jīng)驗將艾姆斯試驗與細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化試驗結(jié)合使用，可篩檢出98%以上的致癌物。
（3）DNA修復(fù)合成試驗：常用方法有程序外DNA合成試驗。 。
4.1、敘述急性毒性實驗的意義2、我國目前常用的藥物致突變實驗有哪些
1：意義（一）創(chuàng)新藥物應(yīng)提供兩種動物的急性毒性試驗資料，一種為嚙齒類動物，另一種為非嚙齒類動物。
（二）溶于水的藥物，嚙齒類動物應(yīng)提供兩種給藥途徑的毒性試驗資料，一種靜脈注射途徑，一種臨床途徑，若臨床用靜脈注射途徑時，可只做靜脈注射的急性毒性試驗。 2：原核生物體外試驗、基因突變。
31.動物品系：一般用兩種動物，一種嚙齒類動物，另一種為非嚙齒類動物。常用SD或Wister大鼠和Beagle狗或者猴。
選用其他動物，應(yīng)說明原因。 2.年齡：根據(jù)試驗期限的長短而定。
大鼠一般6~9周齡。Beagleg狗一般6~12月齡。
試驗開始時體重差異不應(yīng)超過或者低于該次試驗動物平均體重的20%。 3.實驗前至少馴養(yǎng)觀察2周。
觀察記錄動物的行為活動、飲食、體重、精神狀況、心電圖、有關(guān)血液學(xué)及血液生化學(xué)等功能指標(biāo)。選擇正常、健康、雌性無孕動物作為受試動物。
4:?。
5.毒理學(xué)染毒方法有哪些
毒理學(xué) 山東大學(xué) 第一單元 緒論 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 毒理學(xué)主要基本概念 第二單元 外來化合物的生物轉(zhuǎn)運(yùn)和生物轉(zhuǎn)化 第一節(jié) 生物轉(zhuǎn)運(yùn) 第二節(jié) 生物轉(zhuǎn)化 第三節(jié) 毒物動力學(xué) 第三單元 外來化合物毒性作用影響因素和聯(lián)合作用 第一節(jié) 外來化合物毒性作用的影響因素 第二節(jié) 外來化合物聯(lián)合作用 第四單元 急性毒性作用及其試驗方法 第一節(jié) 急性毒性試驗概述及染毒方法 第二節(jié) 急性毒性試驗程序與急性毒性評價 第五單元 亞慢性和慢性毒性作用及其試驗方法 第一節(jié) 亞慢性毒性作用及其試驗方法 第二節(jié) 蓄積作用 第三節(jié) 慢性毒性作用及其試驗方法 第六單元 外來化合物致突變作用及其評價 第一節(jié) 誘發(fā)突變的類型 第二節(jié) 化學(xué)誘變的分子機(jī)理 第三節(jié) 突變后果 第四節(jié) 化學(xué)致突變物的檢測 第七單元 外來化合物致癌作用及其評價 第一節(jié) 概念 第二節(jié) 化學(xué)致癌物及其分類 第三節(jié) 致癌作用的影響因素 第四節(jié) 化學(xué)致癌物危險評價 第八單元 外來化合物的生殖發(fā)育毒性及其評價 第一節(jié) 概念 第二節(jié) 生殖毒性及其評定 第三節(jié) 發(fā)育毒性及其評定 第九單元 外來化合物的免疫毒性作用及其試驗方法 第一節(jié) 外來化合物對免疫功能的影響 第二節(jié) 免疫毒理試驗中常用的方法 第十單元 外來化合物的危險度評定及毒理學(xué)安全性評價程序 第一節(jié) 概述 第二節(jié) 外來化合物危險度評定 第三節(jié) 外來化合物毒理學(xué)安全性評價程序。
