常用蛋白質(zhì)的提取方法優(yōu)缺點(常用來測定蛋白質(zhì)含量的方法)
1.常用來測定蛋白質(zhì)含量的方法有哪些
1、凱氏定氮法
凱氏定氮法是測定化合物或混合物中總氮量的一種方法。即在有催化劑的條件下，用濃硫酸消化樣品將有機氮都轉(zhuǎn)變成無機銨鹽，然后在堿性條件下將銨鹽轉(zhuǎn)化為氨，隨水蒸氣蒸餾出來并為過量的硼酸液吸收，再以標準鹽酸滴定，就可計算出樣品中的氮量。
由于蛋白質(zhì)含氮量比較恒定，可由其氮量計算蛋白質(zhì)含量，故此法是經(jīng)典的蛋白質(zhì)定量方法。
優(yōu)點：可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；操作相對比較簡單；實驗費用較低；結(jié)果準確，是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質(zhì)。
缺點：凱氏定氮法只是一個氧化還原反應(yīng)，把低價氮氧化并轉(zhuǎn)為氨鹽來測定，而不能把高價氮還原為氮鹽的形式，所以不可以測出物質(zhì)中所有價態(tài)的氮含量。
2、雙縮脲法
雙縮脲法是一個用于鑒定蛋白質(zhì)的分析方法。雙縮脲試劑是一個堿性的含銅試液，呈藍色，由1%氫氧化鉀、幾滴1%硫酸銅和酒石酸鉀鈉配制。
當?shù)孜镏泻须逆I時（多肽），試液中的銅與多肽配位，配合物呈紫色。可通過比色法分析濃度，在紫外可見光譜中的波長為540nm。鑒定反應(yīng)的靈敏度為5-160mg/ml。鑒定反應(yīng)蛋白質(zhì)單位1-10mg。
優(yōu)點：測定速度較快，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色深淺相近。
缺點：①靈敏度差；?②?三羥甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等會干擾該反應(yīng)。
3、酚試劑法
取6支試管分別標號，前5支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，不加標準蛋白溶液，在室溫下放置30分鐘，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。
優(yōu)點：靈敏度高，對水溶性蛋白質(zhì)含量的測定很有效。
缺點：①費時，要精確控制操作時間；②酚法試劑的配制比較繁瑣。
4、紫外吸收法
大多數(shù)蛋白質(zhì)在280nm波長處有特征的最大吸收，這是由于蛋白質(zhì)中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用于測定0.1~0.5mg/mL含量的蛋白質(zhì)溶液。
取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標準蛋白溶液，1號試管不加標準蛋白溶液，最后一支試管加待測蛋白質(zhì)溶液，而不加標準蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。
優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后能回收。?
缺點：①測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，專一性差；?②干擾物質(zhì)多，若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等能吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。
5、考馬斯亮藍法
考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據(jù)蛋白質(zhì)可與考馬斯亮藍G-250 定量結(jié)合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質(zhì)結(jié)合后，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變?yōu)?595nm。
在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恒定的情況下，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉(zhuǎn)變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉(zhuǎn)變有一定的數(shù)量關(guān)系。
一般情況，當溶液中的蛋白質(zhì)濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質(zhì)的含量。
優(yōu)點：靈敏度高，測定快速、簡便，干擾物質(zhì)少，不受酚類、游離氨基酸和緩沖劑、絡(luò)合劑的影響，適合大量樣品的測定。
缺點：由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差。
參考資料來源：百度百科-蛋白質(zhì)測定
2.通常蛋白質(zhì)含量測定的方法有哪些,比較優(yōu)缺點
定氮法，雙縮尿法（Biuret法）、Folin-酚試劑法（Lowry法）和紫外吸收法。
考馬斯亮藍法（Bradford法）。 凱氏定氮 靈敏度低，適用于0.2~ 1.0mg氮，誤差為 ±2% 費時 8~10小時 將蛋白氮轉(zhuǎn)化為氨，用酸吸收后滴定 非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少；費時太長 雙縮脲法（Biuret法） 靈敏度低 1~20mg 中速 20~30分鐘 多肽鍵+堿性Cu2+?紫色絡(luò)合物 硫酸銨；Tris緩沖液；某些氨基酸 用于快速測定，但不太靈敏；不同蛋白質(zhì)顯色相似 紫外吸收法 較為靈敏 50~100mg 快速 5~10分鐘 蛋白質(zhì)中的酪氨酸和色氨酸殘基在280nm處的光吸收 各種嘌吟和嘧啶； Folin-酚試劑法（Lowry法） 靈敏度高 ~5mg 慢速 40~60分鐘 雙縮脲反應(yīng)；磷鉬酸-磷鎢酸試劑被Tyr和Phe還原 硫酸銨；Tris緩沖液；甘氨酸； 各種硫醇 耗費時間長；操作要嚴格計時；顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化 考馬斯亮藍法（Bradford法） 靈敏度最高 1~5mg 快速5~15分鐘 考馬斯亮藍染料與蛋白質(zhì)結(jié)合時，其lmax由465nm變?yōu)?95nm 強堿性緩沖液； SDS 最好的方法；干擾物質(zhì)少；顏色穩(wěn)定； 顏色深淺隨不同蛋白質(zhì)變化。
3.各種常見的蛋白質(zhì)定量測定方法的優(yōu)缺點
一、凱氏（kjeldahl）定氮法
優(yōu)點： 用于標準蛋白質(zhì)含量的準確測定；干擾少優(yōu)點
①可用于所有食品的蛋白質(zhì)分析中；
②操作相對比較簡單；
③實驗費用較低；
④結(jié)果準確，是一種測定蛋白質(zhì)的經(jīng)典方法；
⑤用改進方法（微量凱氏定氮法）可測定樣品中微量的蛋白質(zhì)
缺點
①最終測定的是總有機氮，而不只是蛋白質(zhì)氮；
②實驗時間太長（至少需要2h才能完成）；
③精度差，精度低于雙縮脲法；
④所用試劑有腐蝕性.
靈敏度低 適用于0.2-1.0mg氮 干擾物質(zhì) ：非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白質(zhì)而分離） ；費時太長
二 Folin-酚試劑法
優(yōu)點：操作簡便，靈敏度高，比雙縮脲法靈敏得多，樣品中蛋白質(zhì)含量高于5μg即可測得，是測定蛋白質(zhì)含量應(yīng)用得最廣泛的方法之一。
缺點是費時間較長，要精確控制操作時間，標準曲線也不是嚴格的直線形式，且專一性較差，干擾物質(zhì)較多。
對雙縮脲反應(yīng)發(fā)生干擾的離子，同樣容易干擾lowry反應(yīng)。而且對后者的影響還要大得多。酚類、檸檬酸、硫酸銨、tris緩沖液、甘氨酸、糖類、甘油等均有干擾作用。濃度較低的尿素（0.5%），硫酸納（1%），硝酸納（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液對顯色無影響，但這些物質(zhì)濃度高時，必須作校正曲線。含硫酸銨的溶液，只須加濃碳酸鈉—氫氧化鈉溶液，即可顯色測定。若樣品酸度較高，顯色后會色淺，則必須提高碳酸鈉—氫氧化鈉溶液的濃度1~2倍。
此法也適用于酪氨酸和色氨酸的定量測定。
此法可檢測的最低蛋白質(zhì)量達5mg。通常測定范圍是20~250mg。
三、Bradford法的突出優(yōu)點是：
(1)靈敏度高，據(jù)估計比Lowry法約高四倍，其最低蛋白質(zhì)檢測量可達1mg。這是因為蛋白質(zhì)與染料結(jié)合后產(chǎn)生的顏色變化很大，蛋白質(zhì)-染料復(fù)合物有更高的消光系數(shù)，因而光吸收值隨蛋白質(zhì)濃度的變化比Lowry法要大的多。
(2)測定快速、簡便，只需加一種試劑。完成一個樣品的測定，只需要5分鐘左右。由于染料與蛋白質(zhì)結(jié)合的過程，大約只要2分鐘即可完成，其顏色可以在1小時內(nèi)保持穩(wěn)定，且在5分鐘至20分鐘之間，顏色的穩(wěn)定性最好。因而完全不用像Lowry法那樣費時和嚴格地控制時間。
(3)干擾物質(zhì)少。如干擾Lowry法的K 、Na 、Mg2 離子、Tris緩沖液、糖和蔗糖、甘油、巰基乙醇、EDTA等均不干擾此測定法。
此法的缺點是：
(1)由于各種蛋白質(zhì)中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白質(zhì)測定時有較大的偏差，在制作 標準曲線時通常選用 g—球蛋白為標準蛋白質(zhì)，以減少這方面的偏差。
(2)仍有一些物質(zhì)干擾此法的測定，主要的干擾物質(zhì)有：去污劑、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干擾Lowary法一樣）。
(3)標準曲線也有輕微的非線性，因而不能用Beer定律進行計算，而只能用標準曲線來測定未知蛋白質(zhì)的濃度。
四 紫外吸收法
優(yōu)點：簡便、靈敏、快速，不消耗樣品，測定后仍能回收使用。低濃度的鹽，例如生化制備中常用的（nh4）2so4等和大多數(shù)緩沖液不干擾測定。特別適用于柱層析洗脫液的快速連續(xù)檢測，因為此時只需測定蛋白質(zhì)濃度的變化，而不需知道其絕對值。
缺點：測定蛋白質(zhì)含量的準確度較差，干擾物質(zhì)多，在用標準曲線法測定蛋白質(zhì)含量時，對那些與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異大的蛋白質(zhì)，有一定的誤差。故該法適于用測定與標準蛋白質(zhì)氨基酸組成相似的蛋白質(zhì)。若樣品中含有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物質(zhì)，會出現(xiàn)較大的干擾。核酸的干擾可以通過查校正表，再進行計算的方法，加以適當?shù)男Ｕ?。但是因為不同的蛋白質(zhì)和核酸的紫外吸收是不相同的，雖然經(jīng)過校正，測定的結(jié)果還是存在一定的誤差。
五、雙縮脲法（Biuret法）
優(yōu)點：較快速，干擾物質(zhì)少，不同蛋白質(zhì)顯色相似
缺點：不太靈敏
4.蛋白質(zhì)含量的測定都有哪幾種方法,適用情況以及優(yōu)缺點
①凱氏定氮法 原理：蛋白質(zhì)平均含氮量為16%。
當樣品與濃硫酸共熱，蛋白氮轉(zhuǎn)化為銨鹽，在強堿性條件下將氨蒸出，用加有指示劑的硼酸吸收，最后用標準酸滴定硼酸，通過標準酸的用量即可求出蛋白質(zhì)中的含氮量和蛋白質(zhì)含量。 ②雙縮脲法 原理：尿素在180℃下脫氨生成雙縮脲，在堿性溶液中雙縮脲可與Cu2+形成穩(wěn)定的紫紅色絡(luò)合物。
蛋白質(zhì)中的肽鍵實際上就是酰胺鍵，故多肽、蛋白質(zhì)等都有雙縮脲（biuret）反應(yīng)，產(chǎn)生藍色或紫色復(fù)合物。比色定蛋白質(zhì)含量。
缺點：靈敏度低，樣品必須可溶，在大量糖類共存和含有脯氨酸的肽中顯色不好。其 精確度 較差 （數(shù)mg），且會受樣品中 硫酸銨 及 Tris 的干擾，但 準確度 較高，不受蛋白質(zhì)的種類影響。
③Folin酚法（Lowry） Folin酚法是biuret 法的延伸，所用試劑由試劑甲和乙兩部分組成。試劑甲相當于雙縮脲試劑（堿性銅試劑），試劑乙中含有磷鉬酸和磷鎢酸。
在堿性條件下，蛋白質(zhì)中的巰基和酚基等可將Cu2+還原成Cu+, Cu+能定量地與Folin-酚試劑反應(yīng)生成藍色物質(zhì)，600nm比色測定蛋白質(zhì)含量。 靈敏度較高（約 0.1 mg），但較麻煩，也會受 硫酸銨 及 硫醇化合物 的干擾。
步驟中各項試劑的混合，要特別注意均勻澈底，否則會有大誤差。 ④紫外法 280nm光吸收法：利用Tyr在280nm在吸收進行測定。
280nm-260nm的吸收差法：若樣品液中有少量核酸共存按下式計算： 蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）=1.24E280-0.74E260 (280 260為角標) ⑤色素結(jié)合法（Bradford 法） 直接測定法：利用蛋白質(zhì)與色素分子（Coomassie Brilliant Blue G-250）結(jié)合物的光吸收用分光光度法進行測定。 考馬斯亮蘭（CBG）染色法測定蛋白質(zhì)含量。
CBG 有點像指示劑，會在不同的酸堿度下變色；在酸性下是茶色，在中性下為藍色。當 CBG接到蛋白質(zhì)上去的時候，因為蛋白質(zhì)會提供 CBG一個較為中性的環(huán)境，因此會變成藍色。
當樣本中的蛋白質(zhì)越多，吸到蛋白質(zhì)上的CBG也多，藍色也會增強。因此，藍色的呈色強度，是與樣本中的蛋白質(zhì)量成正比。
間接測定法：蛋白質(zhì)與某些酸性或堿性色素分子結(jié)合形成不溶性的鹽沉淀。用分光光度計測定未結(jié)合的色素，以每克樣品結(jié)合色素的量來表示蛋白質(zhì)含量的多少。
⑥BCA法 BCA(Bicinchoninc acid procedure,4,4'-二羧-2,2'-二喹啉)法與Lowry法相似，主要差別在堿性溶液中，蛋白質(zhì)使Cu2+轉(zhuǎn)變Cu+后，進一步以BCA 取代Folin試劑與Cu+結(jié)合產(chǎn)生深紫色，在波長562 nm有強的吸收。 它的優(yōu)點在于堿性溶液中BCA 比Folin試劑穩(wěn)定，因此BCA與堿性銅離子溶液結(jié)合的呈色反應(yīng)只需一步驟即完成。
靈敏度Lowry法相似。 本方法對于陰離子、非離子性及二性離子的清潔劑和尿素較具容忍度，較不受干擾，但會受還原糖 及EDTA的干擾。
⑦膠體金測定法 膠體金（colloidal gold）是氯金酸（chloroauric acid）的水溶膠，呈洋紅色，具有高電子密度，并能與多種生物大分子結(jié)合。 膠體金是一種帶負電荷的疏水膠體遇蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)變?yōu)樗{色，顏色的改變與蛋白質(zhì)有定量關(guān)系，可用于蛋白質(zhì)的定量測定。
⑧其他方法 有些蛋白質(zhì)含有特殊的 非蛋白質(zhì)基團，如 過氧化物酶含有 亞鐵血紅素基團，可測 403 nm 波長的吸光來定量之。 含特殊金屬的酶 （如鎘），則可追蹤該金屬。
5.蛋白質(zhì)分離方法有哪些,它們的特點各是什么
1.根據(jù)分子大小不同進行分離純化 蛋白質(zhì)是一種大分子物質(zhì)，并且不同蛋白質(zhì)的分子大小不同，因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白 質(zhì)和小分子物質(zhì)分開，并使蛋白質(zhì)混合物也得到分離.根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質(zhì)時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜制成的透析袋中，再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜，而蛋白質(zhì)被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質(zhì)大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經(jīng)常和鹽析、鹽溶方法聯(lián)合使用，在進行鹽析或鹽溶后可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由于超濾過程中，濾膜表面容易被吸附的蛋白質(zhì)堵塞，以致超濾速度減慢，截流物質(zhì)的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜，也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經(jīng)常和其它方法聯(lián)合使用的一種分離蛋白質(zhì)的方法.當?shù)鞍踪|(zhì)和雜質(zhì)的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如，在從大米渣中提取蛋白質(zhì)的實驗中，加入纖維素酶和α-淀粉酶進行預(yù)處理后，再用離心的方法將有用物質(zhì)與分解掉的雜質(zhì)進行初步分離[3].使蛋白質(zhì)在具有密度梯度的介質(zhì)中離心的方法稱為密度梯度（區(qū)帶）離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據(jù)所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用于純化蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白，得到的產(chǎn)品純度高但產(chǎn)量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質(zhì)的分離效果，利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇云金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析，是根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同分離蛋白質(zhì)最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質(zhì)流經(jīng)凝膠層析柱時，比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內(nèi)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，而被排阻在凝膠珠之外，隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動并最先流出柱外；反之，比凝膠珠孔徑小的分子后流出柱外.目前常用的凝膠有交聯(lián)葡聚糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果，純度鑒定證明產(chǎn)品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(zhì)（88∶12）、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數(shù)雜蛋白及小分子的雜質(zhì)[7]. 2.根據(jù)溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質(zhì)溶解度的外部條件有很多，比如溶液的pH值、離子強度、介電常數(shù)和溫度等.但在同一條件下，不同的蛋白質(zhì)因其分子結(jié)構(gòu)的不同而有不同的溶解度，根據(jù)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的特點，適當?shù)馗淖兺獠織l件，就可以選擇性地控制蛋白質(zhì)混合物中某一成分的溶解度，達到分離純化蛋白質(zhì)的目的.常用的方法有等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)、蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等. 等電點沉淀和pH值調(diào)節(jié)是最常用的方法.每種蛋白質(zhì)都有自己的等電點，而且在等電點時溶解度最 低；相反，有些蛋白質(zhì)在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調(diào)節(jié)溶液的pH值來分離純化蛋白質(zhì).王洪新等[8]研究茶葉蛋白質(zhì)提取過程發(fā)現(xiàn)，pH值為時茶葉蛋白提取效果最好，提取率達到36·8%，初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質(zhì)時將蛋白溶液的pH值調(diào)到3~4，使目標蛋白于等電點沉淀出來.等電點沉淀法還應(yīng)用于葡萄籽中蛋白質(zhì)的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質(zhì)的等電點為3·8.他們利用堿溶法提取葡萄籽蛋白質(zhì)，得到了最佳的提取工藝為：以1*10-5mol·L-1的NaOH溶液，按1∶5的料液比，在40℃攪拌40 min，葡萄籽蛋白質(zhì)提取率達73·78%.另外還可以利用堿法提取大米蛋白，其持水性、吸油性和起泡性等均優(yōu)于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質(zhì)無腥味、色澤潔白，蛋白質(zhì)產(chǎn)率高達90%[12]. 蛋白質(zhì)的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象，其中，增加蛋白質(zhì)溶解度的現(xiàn)象稱鹽溶，反之為鹽析.應(yīng)當指出，同樣濃度的二價離子中性鹽，如MgCl2、（NH4）2SO4對蛋白質(zhì)溶解度影響的效果，要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用堿溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質(zhì)，其最佳提取工藝是：以10%NaCl溶液，按1∶25的料液比，在30℃攪拌提取30min，蛋白質(zhì)提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法，如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法，其中硫酸銨鹽析法廣泛應(yīng)用于生產(chǎn).由于硫酸銨在水中呈酸性，為防止其對蛋白質(zhì)的破壞，應(yīng)用氨水調(diào)pH值至中性.為防止不同分子之間產(chǎn)生共沉淀現(xiàn)象，蛋白質(zhì)樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質(zhì)進行提純后，通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]. 有機溶劑提取法的原理是：與水互溶的有機溶劑（如甲醇、乙醇）能使一些蛋白質(zhì)在水中的溶解度顯著降低；而且在一定溫度、pH值和離子強度下，引起蛋白質(zhì)沉淀的有機溶劑的濃度不同，因此，控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質(zhì).例如，在冰浴中磁力攪拌下，在4℃預(yù)冷的培養(yǎng)液中緩慢。
