微生物安全知識(微生物實驗室的安全操作規(guī)程)

1.微生物實驗室的安全操作規(guī)程

抄的哦1 實驗室安全 1.1 微生物實驗室的生物安全性 1.2 科室安全文檔 （a）生物危害防護：實際操作規(guī)程見（《實驗室生物安全通用要求》，中華人民共和國國家標準GB19489-2004。

2004-01-05發(fā)布，2004-10-01實施。） （b）實驗室安全：原則和措施見（《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》，中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準WS 233-2002。

2002-12-03發(fā)布，2003-08-01實施。） 1.3 應(yīng)用：以上的操作規(guī)程應(yīng)用于微生物科室的所有部門。

工作人員或訪問人員必須遵守各項規(guī)定。 1.4 關(guān)于新規(guī)定或現(xiàn)行規(guī)定的修改案：任何新規(guī)定或現(xiàn)行規(guī)定的修改案必須通知負責科室安全的人員及相關(guān)人員，他們將建議科室主任考慮實施。

1.5 生物性危害 1.5.1 與各種操作有關(guān)的生物危害水平取決于： a.處理的傳染性物質(zhì)的本身：按照傳染性物質(zhì)對個人和社區(qū)和潛在危險性以及經(jīng)空氣傳播的可能性，其劃分成不同等級。所采用的等級劃分詳見”《實驗室生物安全通用要求》”；原則和措施（見《微生物和生物醫(yī)學實驗室生物安全通用準則》）。

b.使用的設(shè)備和設(shè)施： 處理不同等級的傳染性物質(zhì)的要求在”實驗室安全”中已規(guī)定。這些符合要求的設(shè)備都要承擔重要臨床工作，科室負責人必須保證中應(yīng)污染物水平。

c.培訓，特別是員工的安全性培訓和安全性經(jīng)驗積累。所有員工應(yīng)該接受一定訓練，能安全處理任何實驗室可能碰到的物質(zhì)，避免將實驗不能處理或規(guī)定之外的傳染性物質(zhì)暴露在實驗室，即使暴露事故在實驗室，即使暴露事故發(fā)生也要會正確處理。

1.5.2 傳染性物質(zhì)的分類 1.5.2.1分類系統(tǒng) 生物危害防護：〔見1.2 (a)〕，根據(jù)生物因子對個體和群體的危害程度將其分為4級，危害等級Ⅳ最具危害性。 1.5.2.2危險群/生物安全水平：1-4 a.危險群/生物安全水平：1——對健康成人無致病性，對社區(qū)無危害性。

通常一般微生物操作就足夠，不需特殊安全設(shè)備，工作的附近要有洗手設(shè)施。培養(yǎng)基上包含未鑒定物，因此，妥善處理對各級安全水平都至著重要。

b.危險群/生物安全水平：2——人類疾病相關(guān)物質(zhì)，這種物質(zhì)對實驗室工作人員有中度危險，并具有一定程度社區(qū)危險性。醫(yī)院微生物室所涉及的絕大多數(shù)物質(zhì)屬此安全水平，生物危害警告應(yīng)張貼，并且限制接近，應(yīng)用醒目標語，若是能產(chǎn)生空氣傳播或飛濺的I,II類物質(zhì)都就使用相就的操作臺。

實驗室就提供類似防護衣和手套，眼罩尤其是配戴隱形眼鏡者，也應(yīng)提供類似安全水平的洗手設(shè)施，并且臨近工作區(qū)也應(yīng)有高壓滅菌裝置。所有廢物和反復(fù)使用設(shè)備的去污染應(yīng)有特定的程序。

c.危險群/生物安全水平：3——人類疾病相關(guān)物質(zhì)，具有潛在空氣傳播性，能引起嚴重，致命疾病，對實驗室工作人員高度危險，并具有一定程度社區(qū)危險性。所有含有或懷疑含有生物案的標本必須標以”小心污染”標簽，并且同時標于盛放標本容器和申清單。

然而作為預(yù)防保護還不足夠。應(yīng)對所有血液，體液，分離的人體組織等有普通防護意識，它們都應(yīng)視作傳染源。

在此生物安全級，實驗室應(yīng)控制對其接近。凡涉及該類物質(zhì)都應(yīng)使用I或II類工作臺操作，也可以遵循II級操作注意事項，對所有廢物進行去污染處理，包括工作服和重復(fù)使用設(shè)備。

d.危險群/生物安全水平：4——對個人的危險如生物安全3級，但對社區(qū)有高度危險性。這些傳染性物質(zhì)包括： 蜱源性腦炎病毒 支里半亞-剛果牛血熱病毒 Marburg Virus 艾波拉病毒 Lagsa fever Virus Junin HF Virus Machupo HF Virus Guanaruto HF Virus Herpesvirus simiae (B Virus) 1.6 以下預(yù)防措施，所有實驗工作人員必須遵守： 1.6.1 工作服 a.所有實驗室成員在工作期間必須始終穿著所提供的工作服。

離開實驗室時，工作服須掛在指定地方，不得在實驗室外冼工作服。 b.在處理含有或懷疑含有生物安全3級物質(zhì)的標本時，必須在工作服外穿隔離衣。

c.在生物安全操作臺內(nèi)處理標本和培養(yǎng)基時，必須戴手套。 1.6.2 洗手池 洗手池須供應(yīng)洗潔劑和紙巾。

1.6.3 洗手 所有工作人員在離開工作區(qū)必須洗手，并且要先脫去工作服和手套。 1.6.4 食物，飲水，吸煙，化妝品 食物和飲料不允許帶入任何處理標本的房間.不允許在處理標本的任何地方吸煙.不允許在處理標本的任何地方使用化妝品。

1.6.5 傷口和擦傷 手上的傷口和擦傷必須覆蓋保護物。 1.6.6 個人衣物 個人衣物不允許帶入實驗室，并且必須保存在帶鎖的柜子里。

1.6.7 口吸移液管 這是禁用的。要求使用機械移液裝置。

1.7 常規(guī)預(yù)防措施應(yīng)用于所有血液、體液、組織標本的操作中： 1> 無論何時都應(yīng)盡可能避免使用注射器，針頭或其它銳器。 2> 使用過的針頭和一次性切割器必須丟入專門的帶有蓋子和桶內(nèi)，以備安全處理、防止容器過滿盛裝。

3> 使用過的針頭不許重新使用或再用手操作。 4> 打爛的玻璃必須放入堅硬的容器（不要用手），然后再放入黑色垃圾袋，如果是污染的，使用黃色垃圾袋。

5> 在接觸具有潛在性傳染性標本培養(yǎng)基、組織，必戴保護性手套，防止皮膚直接接觸。如果手套有可見的污染，必須先除去污染，再更換。

手上有皮炎或傷口的工作人員的需要間接接觸傳染性物質(zhì)的人員應(yīng)戴保護性手套。 6> 在處理完標本、結(jié)束工作，甚至在上述規(guī)定帶手套時。

2.微生物知識

美國藥典（USP）中規(guī)定：“將微生物接種至一新鮮培養(yǎng)基上/內(nèi)，每萌發(fā)一次即稱為一代，因此，當原始菌種復(fù)溶并轉(zhuǎn)至一培養(yǎng)基內(nèi)生長，即認為已傳代一次，” 并規(guī)定“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代”。我國的GMP認證中也如此要求，并且中國藥典2005年版藥典也已做出“菌種的傳代次數(shù)（自原始菌種凍干粉起）不得超過5代”這個明確的規(guī)定。

實驗室菌種的傳代保藏過程

1. 按菌種說明書要求復(fù)溶菌粉，轉(zhuǎn)種于適當?shù)脑鼍囵B(yǎng)基內(nèi)（G1），復(fù)壯后轉(zhuǎn)接至平板上，并于適當溫度下培養(yǎng)適當時間，分離出單個純種菌落，此為第2代（G2）。

2. 菌種鑒定完成后，挑取純菌落制成濃菌懸液用于制備甘油冷凍管，同時挑取純菌落轉(zhuǎn)接斜面菌種作為工作用菌種。此時，保藏菌種為第2代，但工作用菌種則為第三代。

3. 將第2代菌種管冷凍保存，將工作用菌種于適當溫度下培養(yǎng)適當時間后可用于試驗。

4. 取一支冷凍保存的G2代菌種轉(zhuǎn)種于平板和斜面培養(yǎng)基上，平板上的菌種制成冷凍保藏管第三代（G3），斜面培養(yǎng)基經(jīng)適當溫度下培養(yǎng)適當時間后用作工作用菌種（W3）。

5. 將第三代菌種（G3）冷凍或低溫保存，將生長、轉(zhuǎn)種后的G2菌種經(jīng)滅菌處理后丟棄。

6. 當工作用菌種代數(shù)小于5時，可直接用上一代工作用菌種轉(zhuǎn)接下一代工作用菌種，如W3可直接轉(zhuǎn)接為W4。

7. 按上述程序操作，直至G4轉(zhuǎn)為W5為止，需重新開啟安瓿，再重復(fù)上述操作程序、保藏和使用菌種。

以上方法中，菌種被分為兩類。傳代用菌種和工作用菌種，傳代用菌種用于甘油冷凍管法保藏，工作用菌種用斜面低溫保藏法保藏。

實驗證明，甘油冷凍管的有效期至少為2年，但其主要適用于細菌（需氧）、酵母菌的傳代、保藏、對厭氧菌、真菌和芽孢類細菌則需應(yīng)用其它方法。

3.生物安全防護知識培訓的基本內(nèi)容有哪些

學員對象：各大醫(yī)院、研究中心、實驗室從事動物實驗的科研人員、工作人員、管理人員等。

課程收益：實驗動物相關(guān)實驗室既涵蓋了一般實驗室的生物安全要求，同時也使得實驗室生物安全變得更加復(fù)雜和多變，人員要求更加嚴格，生物安全事件也相對較多。因此，本課程將重點介紹一些動物實驗相關(guān)實驗室的生物安全知識。

課程內(nèi)容： 【內(nèi)訓課程編號】N101077 【培訓對象】各大醫(yī)院、研究中心、實驗室從事動物實驗的科研人員、工作人員、管理人員等?！九嘤柋尘啊?實驗動物相關(guān)實驗室既涵蓋了一般實驗室的生物安全要求，同時也使得實驗室生物安全變得更加復(fù)雜和多變，人員要求更加嚴格，生物安全事件也相對較多。

因此，本課程將重點介紹一些動物實驗相關(guān)實驗室的生物安全知識?！九嘤柎缶V】 一、你有實驗室生物安全意識嗎？ ●實驗室生物安全是每個實驗室人員應(yīng)該高度重視的問題，實驗的每個環(huán)節(jié)都會有潛在風險。

大家并沒有嚴格、專業(yè)的實驗室風險識別和風險控制的意識和技能，實驗室環(huán)境也沒能形成安全、清潔的文化氛圍，每天都會有許許多多程度不同的生物安全隱患和風險。 ●動物存在哪些危害，怎樣防護等等問題，都需要我們認真思考，至少先要有良好的安全意識，然后形成實驗室安全操作規(guī)范，通常國際上稱為SOP，大家在實驗之前，應(yīng)該了解清楚，才能及時應(yīng)用。

二、你做好動物實驗的準備了么？在動手之前，你認真思考了以下問題嗎？1、你真的了解實驗動物么？ ●實驗動物具有兩大特點：一是為人類需要改變自己，似像非像原種動物，成為“病態(tài)異類”；二是由于遺傳改變，原有抵抗病原的能力呈現(xiàn)不同程度下降，對病原譜系發(fā)生改變，更易得病。 ●實驗動物、分泌物、排泄物、樣品、器官、尸體等控制、操作不當會變成病原污染的擴大器，造成大范圍傳播，因此，了解實驗動物特性，就知道了動物實驗首先要做好思想準備，防備于未然。

2、你具備動物實驗?zāi)芰幔?●動物實驗的能力，包括動物飼養(yǎng)能力、對動物認知能力、操作能力、信息采集能力、分析能力、關(guān)護能力和生物安全防護能力。具備了這些能力，才能完成良好的動物實驗，同時保證實驗中的生物安全。

●動物源人獸共患病，如出血熱、結(jié)核病、狂犬病、菌痢、寄生蟲等疾病更是直接威脅我們健康。實驗既要了解病原的危害，也要了解動物感染后的危害，和可能的生物安全風險，操作中要提高能力，降低風險。

●動物活體檢測、外科手術(shù)、活體采樣、解剖取材等技能更是要求人員能夠熟練掌握。必須經(jīng)過嚴格培訓，才能實際應(yīng)用。

能力，是安全的保證。3、你知道動物實驗要經(jīng)過審查批準么？ ●動物實驗方案審查的內(nèi)容應(yīng)該包括： 實驗人員是否符合操作要求；設(shè)施設(shè)備是否符合動物要求；飼料、墊料、飲水是否符合動物要求；動物運輸是否符合要求；實驗方案是否符合動物福利要求；動物處置是否符合倫理規(guī)范；動物處死是否符合安樂死原則；動物尸體處理是否符合環(huán)保要求等等方面。

這些方面，都要有生物安全作為保障。動物實驗福利、倫理、生物安全審查中應(yīng)注意的問題非常多，主要人員培訓情況； ●動物實驗人員必須經(jīng)過操作培訓，包括：動物基本知識、動物操作、麻醉方法、手術(shù)方法、給藥方法、取材方法、解剖方法、生物安全防護等各種操作，最好持有專業(yè)培訓證書。

三、你具備動物實驗生物安全防護能力嗎？1、你了解動物實驗可能的生物危害嗎？ ●動物實驗可能帶來的危害主要有：一是動物咬傷、抓傷等直接危害；二是動物攜帶人獸共患病病原，在操作過程中通過空氣、分泌物、直接接觸等途徑感染人類；三是人類高致病性病原感染動物實驗，從動物或環(huán)境再感染人。 ●最常見的情況是，實驗動物沒有良好的設(shè)施、設(shè)備作保障，動物污染后處理不當，造成環(huán)境、動物、人員的生物危害。

2、你能識別造成動物生物安全風險的行為嗎？ ●實驗室活動，包括動物實驗的每個環(huán)節(jié)都會存在風險。動物實驗操作中除了我們熟悉的“3R”外，還有一個最重要的R，就是responsibility，是指責任、責任心。

關(guān)護動物，使動物處于相對安靜狀態(tài)，減少動物煩躁不安、過激行為、減少物質(zhì)釋放（如大動物激惹后呼吸增加、激烈活動時揚塵），均可降低產(chǎn)生風險。 ●需要識別的動物相關(guān)風險（10項）3、你知道生物安全管理、風險評估和風險控制嗎？ ●生物安全風險評估和風險控制通俗地講就是要了解實驗可能的各種風險，萬一出現(xiàn)了風險，馬上采取相應(yīng)的應(yīng)對控制手段。

●管理：國家法規(guī)、條例、標準等。國家有專門的要求，病原按危害程度被分為1-4類，1-2類稱為高致病性病原。

所有病原都應(yīng)該在1-4級不同等級生物安全實驗室中進行，并且事先做好生物安全風險評估和風險控制，嚴格操作，以確保安全。應(yīng)根據(jù)危害程度分類，對特定的病原微生物采取相應(yīng)級別的生物安全防護水平，減少人員暴露的危險和使環(huán)境污染降到最低限度。

●動物實驗涉及的所有方面，包括動物、病原、試劑、操作等都應(yīng)預(yù)先知道，并識別可能的危害。根據(jù)危害程度，提出風險評估，采取風險控制措施，是生物安全的核心工作。

●動物的風險評估應(yīng)包括：動物等級、大小、特性、飼養(yǎng)、操。

4.微生物小知識

20

世紀以來，生物化學和生物物理學向微生物學滲透，再加上電子顯微鏡的發(fā)明和同

位素示蹤原子的應(yīng)用，推動了微生物學向生物化學階段的發(fā)展。

1897

年德國學者畢希納發(fā)

現(xiàn)酵母菌的無細胞提取液能與酵母一樣具有發(fā)酵糖液產(chǎn)生乙醇的作用，

從而認識了酵母菌酒

精發(fā)酵的酶促過程，將微生物生命活動與酶化學結(jié)合起來。

諾伊貝格等人對酵母菌生理的研究和對酒精發(fā)酵中間產(chǎn)物的分析，

克勒伊沃對微生物代

謝的研究以及他所開拓的比較生物化學的研究方向，

其他許多人以大腸桿菌為材料所進行的

一系列基本生理和代謝途徑的研究，都闡明了生物體的代謝規(guī)律和控制其代謝的基本原理，

并且在控制微生物代謝的基礎(chǔ)上擴大利用微生物，發(fā)展酶學，推動了生物化學的發(fā)展。從

20

世紀

30

年代起，人們利用微生物進行乙醇、丙酮、丁醇、甘油、各種有機酸、氨基酸、

蛋白質(zhì)、油脂等的工業(yè)化生產(chǎn)。

1929

年，弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉菌能抑制葡萄球菌的生長，揭示了微生物間的拮抗關(guān)系，并

發(fā)現(xiàn)了青霉素。

1949

年，瓦克斯曼在他多年研究土壤微生物所積累資料的基礎(chǔ)上，發(fā)現(xiàn)了

鏈霉素。

此后陸續(xù)發(fā)現(xiàn)的新抗生素越來越多。

這些抗生素除醫(yī)用外，

也應(yīng)用于防治動植物的

病害和食品保藏。

1941

年，比德爾和塔特姆用

X

射線和紫外線照射鏈孢霉，使其產(chǎn)生變異，獲得營養(yǎng)缺

陷型。

他們對營養(yǎng)缺陷型的研究不僅可以進一步了解基因的作用和本質(zhì)，

而且為分子遺傳學

打下了基礎(chǔ)。

1944

年，埃弗里第一次證實了引起肺炎球菌形成莢膜遺傳性狀轉(zhuǎn)化的物質(zhì)是

脫氧核糖核酸

(DNA)

1953

年，沃森和克里克提出了

DNA

分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型和核酸半

保留復(fù)制學說。

富蘭克爾

-

康拉特等通過煙草花葉病毒重組試驗，證明核糖核酸

(RNA)

是遺傳信息的載

體，為奠定分子生物學基礎(chǔ)起了重要作用。其后，又相繼發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)運核糖核酸

(tRNA)

的作用機

制、

基因三聯(lián)密碼的論說、

病毒的細微結(jié)構(gòu)和感染增殖過程、

生物固氮機制等微生物學中的

重要理論，展示了微生物學廣闊的應(yīng)用前景。

1957

年，科恩伯格等成功地進行了

DNA

的體外組合和操縱。近年來，原核微生物基因

重組的研究不斷獲得進展，

胰島素已用基因轉(zhuǎn)移的大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)，

干擾素也已開始用細

菌生產(chǎn)?，F(xiàn)代微生物學的研究將繼續(xù)向分子水平深入，向生產(chǎn)的深度和廣度發(fā)展。

在微生物學的發(fā)展過程中，

按照研究內(nèi)容和目的的不同，

相繼建立了許多分支學科：

研

究微生物基本性狀的有關(guān)基礎(chǔ)理論的有微生物形態(tài)學、

微生物分類學、

微生物生理學、

微生

物遺傳學和微生物生態(tài)學；

研究微生物各個類群的有細菌學、

真菌學、

藻類學、

原生動物學、

病毒學等；

研究在實踐中應(yīng)用微生物的有醫(yī)學微生物學、

工業(yè)微生物學、

農(nóng)業(yè)微生物學、

食

品微生物學、乳品微生物學、石油微生物學、土壤微生物學、水的微生物學飼料微生物學、

環(huán)境微生物學、免疫學等。

由于微生物學各分支學科的相互配合、

互相促進，

以及與生物化學、

生物物理學、

分子

生物學等學科的相互滲透，使其在基礎(chǔ)理論研究和實際應(yīng)用兩方面都有了迅速的發(fā)展

5.微生物有哪些危害

微生物給人們帶來益處，也造成危害。人們利用微生物釀酒，生產(chǎn)檸檬酸，制造抗菌素和酶制劑等。然而微生物也有有害的一面，人、動物和植物的大部分疾病，以及工業(yè)、商業(yè)、外貿(mào)等部門的許多材料和制品的霉變、腐蝕、受損，都是微生物造成的。

這里，我們先來談?wù)勎⑸锏钠茐淖饔谩?/p>

在銀行，計算機電子回路的增強塑料表面繁殖了霉菌，會導(dǎo)致計算機發(fā)生故障，業(yè)務(wù)出現(xiàn)差錯。

不論哪里的銀行，盡管它建筑豪華、設(shè)施齊全，但由于每天有許多人進出，室內(nèi)的微生物污染都十分嚴重。如果對室內(nèi)空氣中浮游的微生物進行一次測量，就會發(fā)現(xiàn)微生物的數(shù)量會出乎意料的多。其中還能分離出致癌性菌株黃曲霉和變色曲霉。

引起室內(nèi)空氣中微生物增加的原因很多，但值得注意的是進出銀行的各個方面的人，他們將從毛發(fā)、衣著、手、物品中散布出微生物來。同時，粘附在紙幣上的霉菌和細菌也會引起第二次污染。試驗已經(jīng)證明，在用纖維材料制作的紙張、地毯和木材上，有許多致病菌存在著。

這種令人憂慮的微生物污染狀況除了銀行之外，醫(yī)院、飯店、寫字樓、百貨大樓、街道、新干線和地下鐵路的電車、公共汽車等的內(nèi)部也存在著嚴重的問題。特別是在醫(yī)院中，每天病人云集，交叉感染時常發(fā)生。進入醫(yī)院是為了治療疾病，但醫(yī)院又是可怕的微生物感染地，這對于一般人是想象不到的。